| 研究課題/領域番号 |
04671113
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
形態系基礎歯科学
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| 研究機関 | 朝日大学 |
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研究代表者 |
金久 純也 朝日大学, 歯学部, 教授 (50121314)
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| 研究分担者 |
山中 武志 朝日大学, 歯学部, 講師 (00230508)
竹内 幹生 朝日大学, 歯学部, 助手 (20247555)
土居 誠司 朝日大学, 歯学部, 助手 (80188838)
山中 真喜子 朝日大学, 歯学部, 助手 (90224120)
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| 研究期間 (年度) |
1992 – 1994
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| 研究課題ステータス |
完了 (1993年度)
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| 配分額 *注記 |
1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
1993年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
1992年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
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| キーワード | 破骨細胞 / Fluorescence Redistribution After Photobleaching(FRAP) / 共焦点レーザースキャニング / 膜物質 / 膜内側方拡散 / 動態解析 / 膜脂質 / グリコプロテイン / ポドゾーム / 細胞骨格 / 封鎖帯 / 骨吸収 |
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| 研究概要 |
破骨細胞(OC)の膜物質の動態を明らかにするために、新生家兎長管骨より分離したOCを用いてFRAP(Fluorescenc Redistribution After Photobleaching)により膜脂質および膜タンパクの側方拡散速度を解析すると共に、細胞内へ移行した膜物質の局在を共焦点レーザースキャニングで3次元的に画像解析した。
1 FRAP
<膜脂質>PBSで洗浄したOCに20mug/mlのNBD-phosphatidyl-choline(NBD-PC)を加えて、室温で20分間負荷した後、ACAS-570レーザー・サイトメーターを用いて細胞上の蛍光分布を2次元画像解析した。そして画像上の蛍光陽性部分の微小領域を、レーザーパルスを照射して、photobleachし、その直後から同領域の蛍光回復を経時的に測定し、周囲からのNBD-PCの拡散速度を解析した。
<グリコプロテイン>4℃のPBS中でOCを80mug/mlのFITC-Wheat Germ Agglutinin(WGA)で30分間標識した後、PCの場合と同様にWGA結合性グリコプロテイン(WGA-GP)の側方拡散速度を解析した。
2 共焦点レーザースキャニング
NBD-PCあるいはFITC-WGAと反応させたOCを37℃の培地中でインキュベートし、経時的に蛍光物質の局在を調べた。NBD-PCによりOC全体に陽性蛍光を認めたが、細胞辺縁部に比べ中央部がより強い蛍光を示した。NBD-PCの側方拡散速度(D)は4.9±1.0×10^<-9>〓/sec(以下mean±SEM)、photo-bleaching後の蛍光回復率(R)は37.7±4.5%であった。NBD-PCの蛍光は室温および37℃で経時的に細い蛍光が認められた。WGA-GPのDはPCより10〜100倍遅く、細胞辺縁部では2.3±0.8×10^<-10>〓/sec、Rは38.1±4.4%、中央部でのDは3.9±1.2×10^<-10>〓/sec、Rは34.7±5.8%であった。なお、OC上のWGA-GPは、37℃で経時的に1〜数カ所に凝集し核周囲領域へ集積した。OCのNBD-PC,WGA-GPの側方拡散は他種の細胞のそれとよく類似した傾向を示したが、測定値のバラツキを大きく、個々のOCの活性状態が多様であることが示唆された。
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