| 研究課題/領域番号 |
04680163
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
物質生物化学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
小林 一雄 大阪大学, 産業科学研究所, 助手 (30116032)
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| 研究期間 (年度) |
1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
1992年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | ロイコトリエン / グルタチオン抱合体 / ATPase / ATP / 肝臓形質膜 |
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| 研究概要 |
ラット肝臓形質膜のcanalicular膜における、システイニルロイコトリエンの一種であるLTC_4のATPに依存した輸送機構を明らかにするために、LTC_4の輸送タンパク質を精製し、その性質を調べた。ラット肝臓より形質膜を単離し、オクチルグルコシド(OG)により可溶化し、2,4-dinitrophenyl glutathione(DNP-SG)が結合したアフィニティカラムおよび高速液体クロマトグラフィーによるゲルロ過を行った。この最終標品をリポソーム膜に再構成したところ、ATPに依存したDNP-SGおよびLTC_4の取り込みが見られ、その輸送活性は形質膜をOGで直接リポソーム膜に再構成したものと比較して、すくなくとも40倍に増加した。またこの再構成系にて、ATPに依存したDNP-SGおよびLTC_4の輸送がみられ、グルクロニドの輸送は観測されなかった。このことはグルタチオン抱合体とLTC_4は同一の輸送体であるが、グルクロニドは別の輸送体であることが分かった。またこの精製したタンパク質はATPase活性が見られ、DNP-SGの添加によりATPase活性が約2倍増加した。またこのATPase活性に対するDNP-SGおよびATPに対するKm値は輸送に対するそれとよく一致することから、このATPase活性と輸送が直接共役していると結論される。またこの輸送タンパク質の分子量はSDS-ゲル電気泳動により、62KDaのmain bandと82KDaと110KDaのバンドが観測された。さらのどのタンパク質が輸送体かを確かめるために、photo-affinity試薬として【^3H】LTC_4および[^<35>S]ATPγSを用い、液体窒素温度で中で各精製過程のタンパク質をキセノンランプにより約20分間光照射後、SDS電気泳動を行った。その結果LTC_4、ATPγSともに62KDaのタンパクがラベルし、62KDaのタクパク質がLTC_4の輸送体であることを確認した。
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