| 研究課題/領域番号 |
04680210
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
放射線生物学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
米井 脩治 京都大学, 理学部, 助教授 (60093340)
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| 研究期間 (年度) |
1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
1992年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
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| キーワード | 活性酸素 / ストレス誘導性遺伝子 / soi / 融合遺伝子 / マキシセル法 / ドットハイブリダイゼーション / ヌクレオチド配列 / 酸素ストレス |
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| 研究概要 |
Mud(Ap、lac)ファージ感染菌からスーパーオキサイドで誘導される融合遺伝子(soi-lacZと名付けた)を持つ8種類の変異株を分離した。これらの遺伝子は、マッピングされた大腸菌遺伝子地図上での位置からこれまでに未発見の遺伝子であることが分かった。しかも、これらの変異株はいずれもスーパーオキサイド増産剤であるメナジオンやメチルビオロゲンに高感受性であるので、酸化的ストレスに対する新しい防護酵素の発見につながる可能性が高い。そこで、まずこれらの遺伝子のクローニングを行った。第一段階で、これらの融合遺伝子をMuから溶原化したλファージ中に転換させた。これによって、λファージはマイトマイシンCによって容易に誘導される。このファージ粒子からDNAを抽出すれば、その中にsoi-lacZが含まれている。このDNAを標識してプローブDNAを作製した。このプローブDNAとハイブリドを形成しうる配列を、クラーク・カーボン遺伝子バンクから検索し、soi10および12遺伝子は、pLC8-9に存在することが分かった。さらに、種々の制限酵素でpLC8-9を切断、サザーンハイブリダイゼーションを行ったところ、soi10/12遺伝子はそのEcoRV2.5KbのDNAフラグメントに存在することが確かになった。この2.5Kbフラグメントを持つプラスミドの産生タンパクをマキシセル法で調ベた。soi10/12遺伝子産物は約32KDaのタンパクであった。さらに、このプラスミドをsoi10/12-lacZ変異株に導入すると、変異株のメナジオン高感受性は相補された。この事実は、2.5Kbフラグメントには明らかにsoi10/12遺伝子が含まれていることを示している。この2.5Kbのデリーションセットを作製して個々のヌクレオチド配列をダイデオキシ法で決定した。2.5Kbフラグメントには32KDaのタンパクをコードするORFが含まれていた。
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