| 研究課題/領域番号 |
04807153
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
化学系薬学
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
斉藤 和季 千葉大学, 薬学部, 助教授 (00146705)
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| 研究分担者 |
山崎 真巳 千葉大学, 薬学部, 教務職員 (70222370)
村越 勇 千葉大学, 薬学部, 教授 (30009162)
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| 研究期間 (年度) |
1992 – 1993
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| 研究課題ステータス |
完了 (1993年度)
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| 配分額 *注記 |
1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
1993年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
1992年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
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| キーワード | トランスジェニック植物 / 二次代謝 / システイン生合成 / 遺伝子工学 / タンパク質工学 / cDNAクローニング / システイン合成酵素 |
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| 研究概要 |
【目的】高等植物からのアミノ酸生合成などの物質代謝遺伝子の単離は、かならずしも容易ではなく、大量の酵素タンパク質の精製をおこなわない簡便なcDNAクローニング法の開発が必要である。今回演者らは、遺伝的相補性によるクローニング戦略を開発し、スイカ(Citrullus vulgaris)より硫黄同化経路の中心に位置するシステイン合成酵素(CSase)cDNAの単離に成功した。さらにこのCSase cDNAを大腸菌で大量発現させ、非タンパク性β-置換アラニン類の生合成に成功した。
【方法・結果】スイカの黄化発芽体より発現型cDNAプラスミドライブラリーを構築し、遺伝的相補性を利用することにより、スイカからCSase cDNAの単離に成功した。1.5×10^5クローンからなるプラスミドライブラリーを、2個のシステイン合成酵素遺伝子座(cysK,cysM)が欠失しシステイン要求性となった大腸菌NK3に導入したところ、システイン要求性を機能的に相補する13個のクローンを単離した。これらのクローンは塩基配列の決定の結果、単一の遺伝子由来で325アミノ酸残基からなる分子量34、342のポリペプチドをコードしていることが示された。またゲノムDNAのサザン分析の結果、ゲムノ中に1コピー存在することが明らかになった。次に緑色及び黄化発芽体の子葉、胚軸、幼根より全RNAを調製しノーザン分析をおこなったところ、いずれの部位においても、構成的に発現していた。次にこのcDNAの大腸菌高発現系を作製し、ウリ科植物に特異的な非タンパク性アミノ酸であるβ-ピラゾールアラニンをはじめいくつかの二次代謝性アミノ酸のin vitroおよびin vivo合成に成功した。
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