| 研究課題/領域番号 |
04833006
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
分子細胞生物学
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
久永 眞市 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (20181092)
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| 研究期間 (年度) |
1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
1992年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | ニューロフィラメント / リン酸化 / キナーゼ / cdcキナーゼ / 中間径線維 |
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| 研究概要 |
神経細胞に特異的な中間径繊維であるニューロフィラメントは、神経細胞内で最もリン酸化されている蛋白の一つである。しかし、ニューロフィラメントをリン酸化しているキナーゼについては全く解っていない。本研究では、脱リン酸化したNF蛋白を基質として、ブタ脳からニューロフィラメントのHサブユニット(NFH)を選択的にリン酸化するキナーゼを精製した。ブタ脳から微小管を重合させ、遠心分離したところ、ほとんどのNFHキナーゼ活性は微小管と共に沈澱分画に回収された。NFHキナーゼを微小管分画から高塩濃度溶液で抽出した後、DEAE、ハイドロキシアパタイト、硫安分画、Superose6によるゲルロ過、MonoQ、SPイオン交換の各カラムクロマトグラフィーを通すことにより高度に精製した。最終精製過程による活性とSDS-PAGEによる蛋白の挙動を調べることにより32Kと25Kの2つのサブユニットから成っていることが示された。NFHキナーゼはニューロフィラメントの3つのサブユニットのうち脱リン酸化されたNFHを最もよい基質とした。NFHのin vivoのリン酸部位に対する抗体を用いてブロッティングしたところ、NFHキナーゼによるリン酸化で、抗原性が回復し、NFHキナーゼがNFHのin vivoのリン酸化部位をリン酸化していることが示された。キナーゼの基質としてよく知られている蛋白をいくつか基質として調で、ヒストンH1がよい基質であることが解った。ヒストンH1キナーゼとして知られているcdc2キナーゼとの関連を調べたるため、抗PSTAIR抗体でブロッティングしたが、いずれのサブユニットにも反応しなかった。しかし、cdc2キナーゼと特異的に結合的に結合する酵母のsuc1蛋白とはcdc2キナーゼと同様に結合した。NFHKは神経細胞に特異的なcdc2に関連したキナーゼであると推測された。
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