| 研究概要 |
真核生物の染色体DNAの複製開始は、サイクリン依存性キナーゼ活性(CDK)の低い時期に起こる複製開始点でのpre-Replicative Complex (pre-RC)の形成と、CDKの活性化とともに起こるDNA合成酵素の複製開始点への結合に分けることができる。本研究では、出芽酵母の両過程に必要な因子を精製し、それぞれの間での結合能を調べた。Pre-RCの形成は、6つのサブユニットからなるOrigin recognition complex (Orc)が複製開始点に結合し、その後ヘリケース活性を示すMcm複合体(Mcm2〜7よりなる)が結合する。この反応にはCdc6とCdt1が必要である。我々は、Orc, Mcmを出芽酵母から、Cdc6,Cdt1を大腸菌発現細胞から精製し、相互作用を調べた。その結果、Cdc6及びCdt1がMcm, Orcに結合することが分かった。Cdt1とOrcの結合は、本研究により明らかになったものである。次に、DNA合成酵素の複製開始点への結合に必要なSld3,Cdc45を大腸菌から、Dpb11,Sld2を酵母から、GINS (Sld5,Psf1,Psf2,Psf3のサブユニットから成る)をバキュロウィルスによる昆虫細胞発現系から、精製した。複製の開始に伴って、Mcm, Cdc45,GINSの強固な複合体が形成することが報告されているが、この複合体形成においてSld3が重要な役割を果たしていることが分かった。即ち、Cdc45,GINS単独ではMcmに結合しないが、Sld3を加えると結合することが出来る。このことは、Sld3を介してまずCdc45,GINSがMcmに結合することを意味する。さらに、Dpb11がOrcと結合することも分かった。これは、合成酵素がどのように複製開始点にリクルートされるかの解明への糸口となるものである。
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