異種の卵細胞質を利用した初期化誘導法によるラット体細胞クローン個体の作出

• 研究課題/領域番号: 04J03474
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 応用動物科学
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 富岡 郁夫 東北大学, 大学院農学研究科, 特別研究員(DC1)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 2,800千円 (直接経費: 2,800千円); 2006年度: 900千円 (直接経費: 900千円); 2005年度: 900千円 (直接経費: 900千円); 2004年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
• キーワード: ラット / マウス / 体細胞クローン / アフリカツメガエル / 核移植 / 初期化 / リプログラム / 脱分化 / 異種の卵細胞質 / 連続核移植 / 細胞骨格

研究概要

<目的)
体細胞クローン技術の成功により卵子がリプログラム能力を持つことが示された。近年、アフリカツメガエル(Xenopus)未受精成熟卵子にも哺乳類の体細胞をリプログラムする能力があることが報告された。そこで本研究はXenopus卵子抽出液で体外培養細胞をリプログラムし、生殖工学技術へ応用すること、およびリプログラム化細胞の能力の検討を目的とした。
<方法)
Xenopus排卵卵子を遠心分離することで水層を抽出した。(1)GFP遺伝子導入マウス胎仔線維芽細胞を透過処理し、Xenopus卵子抽出液に1時間暴露処理し、継続培養した。処理後6日目の細胞から、Oct-3/4をRT-PCRにより検出した。(2)処理細胞がどのような形質を持ったのか調べる目的で、内中外胚葉特異的遺伝子、生殖腺分化関連遺伝子、ES細胞関連遺伝子および卵子卵胞関連遺伝子の発現.についてRT-PCRにより網羅的に解析した。(3)リプログラム化細胞をドナーとし核移植に供試した。電気融合法により核移植胚を作出し、塩化ストロンチウムにより活性化を誘起し発生を観察した。
<結果・考察)
(1)Xenopus卵子抽出物処理後6日目の細胞でOct-3/4の発現が認められ、リプログラム化された。(2)リプログラム化細胞の遺伝子発現を解析した結果、生殖腺の分化に関連する遺伝子であるGata4,Lhx9,BMP4およびSf-1の発現が認められた。Oct-3/4の発現やアルカリフォスファターゼ活性も検出されたため、リプログラム化細胞は生殖腺の方向へのリプログラムと推察された。(3)リプログラム化細胞を用いて核移植を行った結果、無処理の細胞区より分割率(86% vs 73%)、胚盤胞期胚形成率(61% vs 29%)ともに有意に高くなった。これまでリプログラム化は分子生物学的手法によってのみ証明されてきたが、本研究は初めてリプログラム化を現象として顕した有益なものである。

研究成果

• [雑誌論文] Pronuclear formation and mitotic assembly during the first division in rat reconstructed embryos produced by somatic nuclear transfer. (2007)
  • 著者名/発表者名: Ikuo Tomioka, Eiji Mizutani, Tomoyuki Yoshida, Atsushi Sugawara, Kentaro Inai, Hiroshi Sasada, Eimei Sato.
  • 雑誌名: Journal of Reproduction and Development 56(in press)
• [雑誌論文] 近年のラット発生工学の進歩 (2007)
  • 著者名/発表者名: 富岡郁夫, 松本阿佐子, 清水隆, 佐藤英明
  • 雑誌名: 東北畜産学会報 56(3) ページ: 19-25
• [雑誌論文] Development of rat tetraploid and chimeric embryos aggregated with diploid cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Shinozawa T, Sugawara A, Matsumoto A, Han YJ, Tomioka I, Inai K, Sasada H, Kobayashi E, Matsumoto H, Sato E.
  • 雑誌名: Zygote 14 ページ: 287-297
• [雑誌論文] Bax Inhibiting Peptide (BIP) designed from mouse and rat Ku70 (2004)
  • 著者名/発表者名: Tomoyuki Yoshida, Ikuo Tomioka, Takako Nagahara, Trudy_Holyst, Motoshi Sawada, Paulette Hayes, Vivian Gama, Misako Okuno, Yohong Chen, Yasuyuki Abe, Tadashi Kanouchi, Hiroshi Sasada, Demin Wang, Takanori Yokota, Shigemi Matsuyama, Eimei Sato
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 321 ページ: 961-966