ウイルス蛋白質に結合する宿主細胞由来因子の網羅的検索

• 研究課題/領域番号: 04J03829
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 生物系薬学
• 研究機関: 国立感染症研究所
• 研究代表者: 高橋 直子 国立感染症研究所, 生物活性物質部, 特別研究員(PD)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 3,400千円 (直接経費: 3,400千円); 2006年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円); 2005年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円); 2004年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
• キーワード: カポジ肉腫ウイルス / LANA / Brd4

研究概要

これまでに、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスのLANAと宿主細胞由来因子Brd4が結合することを見いだした。実際にウイルスが感染しているBCBL-1細胞において、LANAとBrd4とは結合していた。また、免疫染色法によりBCBL-1細胞内でLANAとBrd4は共に核内に存在し、局在が部分的に一致していることがわかった。
部分的にアミノ酸残基を欠損したLANAおよびBrd4が互いに結合するか否かを検討した結果、LANAについては1139番目から1162番目のアミノ酸の領域がBrd4との結合に重要であり、Brd4についてはN末端側に含まれるセリン残基に富んだ2つの領域及びETドメインと呼ばれる領域がLANAとの結合に重要であることがわかった。
一方、大腸菌で発現させて精製したBrd4及びLANAの蛋白質断片がin vitroで結合したことから、Brd4とLANAは直接結合することが示唆された。
Brd4はP-TEFb(CyclinT1/Cdk9)と結合し、細胞内の転写を安定化していることが以前に報告されている。そこで、HAタグを付加したBrd4及びFLAGタグを付加したLANAを発現させたHEK293T細胞の抽出液にっいて、抗HA、及び抗FLAG抗体を用いた2段階の免疫沈降を行ったところ、2段階の免疫沈降の結果得られた蛋白質複合体中にBrd4、LANA及びP-TEFbが含まれていたことから、これらが細胞内で一つの複合体として存在することが示唆された。次に、細胞内でBrd4及びLANAを共発現させると、AP1及びE2F結合部位の下流のルシフェラーゼ遺伝子の発現が上昇したが、ETドメインを欠損しLANAと結合しないBrd4を用いた場合には野生型Brd4を用いた場合ほど上昇しなかったことから、LANAはBrd4と相互作用することによって細胞内の転写に影響を与えていると考えられる。

研究成果

• [雑誌論文] Ets-1-dependent expression of vascular endothelial growth factor receptors is activated by latency-associated nuclear antigen of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus through interaction with Daxx. (2006)
  • 著者名/発表者名: Murakami Y., et al.
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 281 ページ: 28113-28121
• [雑誌論文] Mechanism for the degradation of origin recognition complex containing Orc5p with a defective Walker A motif and its suppression by over-production of Orc4p in yeast cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Makise M., et al.
  • 雑誌名: Biochemical Journal 402 ページ: 397-403
• [雑誌論文] ADP-binding to origin recognition complex of Saccharomyces cerevisiae. (2004)
  • 著者名/発表者名: Takenaka H, Makise M, Kuwae W, Takahashi N, Tsuchiya T. Mizushima T.
  • 雑誌名: Journal of Molecular Biology 340・1 ページ: 29-37