| 研究分担者 |
BEECHEM J.M. バンダービルト大学, 医学部, 助教授
MARDH Sven リンシェピング大学, 生命科学部, 教授
嘉屋 俊二 北海道大学, 理学部, 講師 (90186023)
BEECHEM M.joseph Vanderbilt University, Associate Prefessor
J.M. Beachem バンダービルト大学, 医学部, 助教授
SVEN Mardh リンシェピング大学, 医学部生理化学部, 教授
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| 研究概要 |
1.Na^+,K^+-ATPaseをBIPMとFITCとで2重標識した標品を用いて、リン酸化反応中間体(EP)の形成と分解(モ-ルド研究室)及び蛍光強度変化(ビ-チャム研究室)を追跡した。BIPMらかFITCプローブへの蛍光エネルギー移動はNa^+結合酵素の状態を基準にとると,Na^+閉塞酵素で減少し,酢酸感受性リン酸化酵素(E_1P)で増加、K^+感受性リン酸化酵素(E_2P)で最大に達し、K^+結合酵素で減少、Na^+結合酵素基準値に戻ることが示された.本酵素標品を用い、ポリクロメーターによる各反応中間体と分解のプロセスの測定を行った。Na^+閉塞酵素にアセチルリン酸(Acp)を添加すると、BIPM蛍光励起によるBIPM蛍光の増加(5/s)とBIPMプローブからFITCプローブへのエネルギー移動によるFITC蛍光の増加(11/s)と減少(0.7/s)が観察された。FITCプローブの単独励起でも増加(5/s)と減少(0.05/s)が観察された。BIPM蛍光は増加と共にred shift、エネルギー移動に基づくFITC蛍光はわずかにblue shift、直接励起のFITC蛍光はred shiftした。両プローブ間距離をForsterの式を用いて計算した。その結果Cys-964に結合しているBIPMプローブからLys-510に結合しているFITCプローブ距離は役36Åと推定された。
2.H^+,K^+-ATPaseをK^+非存在下でBIPM修飾Mg^<2+>の存在下、ATPを添加するとBIPM蛍光の可逆的な減少が観察された。α鎖当たり0.85molのBIPMが導入された標品をTPCK trypsinで処理すると、BIPM蛍光はほぼ定量的に可溶化された。可溶画分を逆相HPLCを用い、蛍光強度変化がほぼ一定にもかかわらず、BIPM結合量の増加に伴って増加し全蛍光の50%を占めるピークを得た。このピークのアミノ酸配列はSer-Pro-Glu-X-Thr-His-Glu-Ser-Pro-Leu-Glu-Thr-Argであり、ブタ胃H^+,K^+-ATPaseの一次構造からXはCys-241と同定した。以上の結果その他からH^+,K^+-ATPaseのリン酸化に伴う蛍光減少はCys-241に結合したBIPMプローブによると結論した。
3.Na^+,K^+-ATPaseとH^+,K^+-ATPaseは共にK^+感受性リン酸化酵素(E_2P)の蓄積に伴って、Trp残基の蛍光を増加した。一方、H^+,K^+-ATPaseのCys-241のBIPM蛍光は減少、Na^+,K^+-ATPaseのCys-964のBIPM蛍光は増加する。TPCK trypsin処理によってCys-241に結合したBIPMプローブを含むtridecapeptideが容易に限定的に可溶化されたことは、Hydropathyplotその他から、細胞質側の可溶性部位にCys-241が存在するとした結果を支持する。Na^+,K^+-ATPaseのCys-964に結合したBIPMプローブの蛍光変化は酵素標品中のphospholipidsの分解で消失し、C_<12>E_8(octacethylene glycol n-dodecyl ether)で強い消光を受ける。蛍光エネルギー移動による距離の推定その他はBIPMプローブの位置は細胞質間から数Å内部に存在することを示唆している。
Na^+,K^+-ATPaseをphosphatase基質[^<32>P]Paranitrophenylphosphate(PNPP)Mg^<2+>とNa^+の存在下でリン酸化すると定常状態で[^<32>P]ATPでリン酸化されるほぼ倍量のEPが形成された。SDS処理で得られた高純度のNa^+,K^+-ATPase標品、又DOC-NaI処理標品を用いouabainの結合量、CDTA存在下でのATPの結合量及びATPからのEP形成量を比較した結果、その比は約1:0.75:0.5となり、E_1PのPNP感受性も考慮するとNa^+,K^+-ATPaseの膜中での機能単位は(αβ)_2よりさらに高度のオリゴマーである可能性が高い。
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