糸状菌の第一次病原性決定因子:宿主特異的毒素の生合成,識別,及び解毒の分子機構

• 研究課題/領域番号: 05044133
• 研究種目: 国際学術研究
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 共同研究
• 研究機関: 鳥取大学
• 研究代表者: 甲元 啓介 鳥取大学, 農学部, 教授 (80032093)
• 研究分担者: BRIGGS S.P. パイオニア, ハイブレツド社・生物工学研究部, 上級研究員 ; SCOTTーCRAIG クレエイグ ジェイ. ミシガン州立大学, DOEMSU植物研究所, 上級研究員 ; TURGEON B.G. コーネル大学, 植物病理学科, 上級研究員 ; WALTON J.D. ミシガン州立大学, DOEMSU植物研究所, 準教授 ; BRONSON C.R. アイオワ州立大学, 植物病理学科, 準教授 ; YODER O.C. コーネル大学, 植物病理学科, 教授 ; 田平 弘基 鳥取県園芸試験場, 研究員 ; 児玉 基一朗 鳥取大学, 農学部, 助手 (00183343) ; 秋光 和也 香川大学, 農学部, 助教授 (80263888) ; 柘植 尚志 名古屋大学, 農学部, 助教授 (30192644) ; 小林 裕和 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助教授 (80170348) ; 中島 広光 鳥取大学, 農学部, 助教授 (40144646) ; 尾谷 浩 鳥取大学, 農学部, 教授 (50032305) ; AKIMITSU K. ミシガン州立大学, 植物病理学科, 研究員
• 研究期間 (年度): 1993 – 1994
• 研究課題ステータス: 完了 (1994年度)
• 配分額: 10,000千円 (直接経費: 10,000千円); 1994年度: 5,000千円 (直接経費: 5,000千円); 1993年度: 5,000千円 (直接経費: 5,000千円)
• キーワード: 宿主特異的毒素 / Tox1 / Tox2 / HTS1 / 毒素生合成遺伝子 / 抵抗性遺伝子 / Alternaria / Cochliobolus / 毒素生合成酵素 / 毒素レセプター / 解毒酵素 / 遺伝子破壊

研究概要

1.AM毒素生合成に関与する酵素とその遺伝子:(1)環状ペプチド生合成に特徴的なATP/PPi交換反応を指標として、リンゴ斑点落葉病菌の発芽胞子および培養菌糸体から、AM毒素の構成アミノ酸に依存する活性を見いだし、その部分純化を行なった。(2)環状ペプチドであるHC毒素の生合成遺伝子のアミノ酸活性化ドメインDNA保存配列をプライマーとしてPCR法でAM毒素生合成遺伝子の探索を行なった。リンゴ斑点落葉病菌による増幅活性が見られたが、特異性の点で問題を今後に残した。
2.AK毒素生合成遺伝子: ナシ黒斑病菌からAK毒素欠損株2株を分離し、野生株DNAによる変異相補法による毒素生産遺伝子クローニングを試みた。3000株以上の形質転換体の毒素生産能を検定したが、毒素回復株は得られていない。つぎに遺伝子タギング法を試みた。ハイグロマイシンB抵抗性遺伝子をマーカーとするベクターpSH75をAK毒素生産株に導入し、得られた形質転換体約2000株から1株の毒素欠損株を得た。pSH75は複数の染色体領域にタンデムに反復挿入されていた。ベクターDNA挿入領域の同定と近傍配列を回収中。
3.HMT毒素生合成遺伝子(TOX1): TOX1にポリケタイド合成酵素(PKS)のacyltransferase保存領域DNAを挿入し、毒素生産能喪失変異株(C4.PKS13)を得、野生株と比較して染色体の540kb断片の欠損に伴う440kb断片の置換が起きていて、この部分がHMT毒素生合成に必須であることが明らかとなった。また、REMI法でタギング後、1300の形質転換体から毒素生産能喪失変異株2株(R.C4.186 & R.C4.350L)を得た。これらの株に挿入された塩基配列の分析結果はPKSのアシルキャリヤ-蛋白質の領域にプラスミドが挿入されていることを示し、TOX1ローカスがHMT毒素生合成に必須なPKSをコードしていることを確実にした。さらに、TOX1は単一のローカスではなく、2つの染色体の相互転座の切断部位あるいはそのごく近傍に座乗している2つのローカスであり、これら通常の遺伝学的分析では分離不能で、今回初めて分子遺伝学的手法の利用でこれが発見された。
4.HC毒素生合成遺伝子HTS1の構造と機能: 22kbHTS1にコードされている570kDのHC毒素生合成酵素は、純化の過程でHTS-1及びHTS-2とよばれる異なる活性を持つ2つの酵素断片に分離する。HTS-1はL-プロリンを活性化しチオアシル化するとともにD-プロリンに光学異性化し、HTS-2はL-及びD-アラニンを活性化しL-アラニンをD-アラニンに異性化する。本酵素は他の環状ペプチド生合成酵素と類似のドメイン4つ(A〜D)を持つ。これらのドメインをコードしている遺伝子領域をpETベクターにそれぞれサブクローンし大腸菌を用いて発現させた。各ドメイン遺伝子産物ペプチドはSDS-PAGEで分離後、HTS抗体で調べた結果、BはHTS-1の、CはHTS-2の一部であった。バキュロウイルス系を用いて発現させるとドメインBからL-プロリン依存の高い酵素活性を得た。一方、HC毒素生成に必要な他の遺伝子の存在が明らかとなった。HTS1の5′隣接領域に存在する2.1kbのTOXAはHC毒素の排出に、TOXCは毒素構成員の2-アミノエポキシデカン酸の生合成に関与するらしい。
5.非特異的侵略力の分子生物学的解析:メラニン合成能欠損のアルターナリア病原菌、多糖分解酵素欠損のコクリオボーラス病原菌、およびクチン分解酵素導入のコクリオボーラス病原菌が研究された。
6.毒素レセプター:AK毒素感受性のナシ培養細胞に特異的に存在する蛋白質を検出した。HV毒素の結合蛋白質の細胞内局在性とその役割を免疫学的手法で明らかにした。
7.HC毒素抵抗性遺伝子の構造と機能: 病害抵抗性遺伝子Hm1がHC毒素の還元解毒酵素をコードしていることを確定した。
8.なお、研究成果の一部は第2回鳥取大学HST国際シンポジウム記録集(1994)として刊行した。

研究成果

• [文献書誌] Turgeon,B.G.et al.: "Cloning and analysis of the matig type genes from Cochliobolus heterostrophus" Mol.Gen.Genet.238. 270-284 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Adachi,Y.et al.: "Nuclear ribosomal DNA as a probe for genetic variability in the Japanese pear pathotype of Alternaria alternata" Appl.Environ.Microbiol.59. 3197-3205 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kimura,N.et al.: "Gene cluster involved in melanin biosynthesis of the filamentous fungus Alternaria alternata" Jour.Bacteriol.175. 4427-4435 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Walton,J.D.et al.: "Host-selective toxins and disease specificity:Perspectives and progress" Annu.Rev.Phytopathol.31. 275-303 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Nutsugah,S.K.et al.: "Production of a host-specific toxin by germinating spores of Alternar tenuissima causing leaf spot of pigeon pea" Jour.Phytopathol.140. 19-30 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Oikawa,H.et al.: "Absolute configuration of main chain of AAL-toxins" Tetrahedron. 50. 13347-13368 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Akimitsu,K.et al.: "Light suppresses the action of the host-specific ACR-toxin on citrus leaves" Jour.Fac.Agric.,Tottori Univ.30. 17-27 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kusaba,M.et al.: "Nuclear ribosomal DNA variation and pathogenic specialization in Alternaria fungi known to produce host-specific toxins" Appl.Environ.Microbiol.60. 3055-3062 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Briggs,S.P.et al.: "Genetic patterns of plant host-parasite interactions" Trends in Genetics. 10. 12-16 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Walton,J.D.: "Deconstructing the cell wall" Plant Physiol.104. 1113-1118 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Schaeffer,H.J.et al.: "Cloning and targeted gene disruption of EXG1,encoding exo-B1,3-glucanase,in the phytopatho genic fungus cochliobolus carbonum" Appl.Environ.Microbiol.60. 594-598 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yang,G.et al.: "Toxin-deficient mutants from a toxin-sensitive transformant of Cochliobolus heterostrophus" Genetics. 137. 751-757 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Oeser,B.et al.: "Pathogenesis by Cochliobolus heterostrophus transformants expressing a cutinaseencoding gene from Nactria haematococca" Molecular Plant-Microbe Interactions. 7. 282-288 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Lu,S.et al.: "Tagged mutations at the Tox1 locus of Cochliobolus heterostrophus by restriction enzyme-mediated in tegration" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 91. (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Johal,G.S.et al: "A tale of two mimics;transposon mutagemesis and characyterization of twodirease lesion mimic mutations of maize" Maydica. 39. 69-76 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Tanabe,K.et al.: "Characterization and pathogenicity of melamin-deficient mutants of Alternaria alternata Japanese pear pathotype" Ann.Phytopath.Soc.Japan. 61(in press).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Otani,H.et al.: "Alternaria toxins and their effects on host plants" Canad.Jour.Botany. 73(in press).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Reynolds,D.R.et al.eds.: "The Fungal Holomorph:Mitotic,Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics" CAB International, pp.199-215 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Coruzzi,G.et al.,eds.: "Plant Molecular Biology" Springer-Verlag, pp.219-227 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Singh,U.S.,Kohmoto,K.et al.: "Pathogenesis and Host Specificity in Plant Diseases,vol.11" Pergamon Press, pp.51-63 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 吉川正明(編): "分子植物病理学の最近の進歩" 日本植物病理学会, (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Daniels,M.J.et al.: "Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions,vol.3" Kluwer Academic Press, pp.223-237 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kohmoto,K.and Yoder,O.C.: "Host-Specific Toxin:Biosynthesis,Receptor and Molecular Biology (Proceedings of the Second Tottori University International Symposium on Host-Specific Toxins,Tottori,1993)" Tottori University, 313 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Turgeon, B.G.et al.: "Cloning and analysis of the mating type genes from Cochliobolus heterostrophus" Mol.Gen.Genet.238. 270-284 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Adachi, Y.et al.: "Nuclear ribosomal DNA as a probe for genetic variability in the Japanese pear pathotype of Alternaria alternata" Appl.Environ.Microbiol.59. 3197-3205 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kimura, N.et al.: "Gene cluster involved in melanin biosynthesis of the filamentous fungus Alternaria alternata" Jour.Bacteriol.175. 4427-4435 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Walton, J.D.et al.: "Host-selective toxins and disease specificity : Perspectives and progress" Annu.Rev.Phytopathol.31. 275-303 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Nutsugah, S.K.et al.: "Production of a host-specific toxin by germinating spores of Alternaria tenuissima causing leaf spot of pigeon pea" J.Phytopathology. 140. 19-30 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Oikawa, H.et al.: "Absolute configuration of main chain of AAL-toxins" Tetrahedron. 50. 13347-13368 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Akimitsu, K.et al.: "Light suppresses the action of the host-specific ACR-toxin on citrus leaves" Jour.Fac.Agric., Tottori Univ.30. 17-27 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kusaba, M.et al.: "Nuclear ribosomal DNA variation and pathogenic specialization in Alternaria fungi known to produce host-specific toxins" Appl.Environ.Microbiol.60. 3055-3062 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Briggs, S.P.et al.: "Genetic patterns of plant host-parasite interactions" Trends in Genetics. 10. 12-16 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Walton, J.D.: "Deconstructing the cell wall" Plant Physiol.104. 1113-1118 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Schaeffer, H.J.et al.: "Cloning and targeted gene disruption of EXG1, encoding exo-beta1,3-glucanase, in the phytopathogenic fungus Cochliobolus carbonum" Appl.Environ.Microbiol.60. 594-598 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yang, G.et al.: "Toxin-deficient mutants from a toxin-sensitive transformant of Cochliobolus heterostrophus" Genetics. 137. 751-757 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Oeser, B.et al.: "Pathogenesis by Cochliobolus heterostrophus transformants expressing a cutinase-encoding gene from Nectria haematococca" Molecular Plant-Microbe Interactions. 7. 282-288 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Lu, S.et al.: "Tagged mutations at the Tox1locus of Cochliobolus heterostrophus byrestriction enzyme-mediated integration" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 91. (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Johal, G.S.et al.: "A tale of two mimics ; transposon mutagenesis and characterization of two disease lesion mimic mutations of maize" Maydica. 39. 69-76 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Tanabe, K.et al.: "Characterization and pathogenicity of melanin-deficient mutants of Alternaria alternata Japanese pear pathotype" Ann.Phytopathol.Soc.Japan. 61 (in press).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Otani, H.et al.: "Alternaria toxins and their effects on host plants" Can.Jour.Botany. 73 (in press).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Reynolds, D.R.et al., eds.: CAB International, London. The Fungal Holomorph : Mitotic, Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics, 199-215 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Coruzzi, G.et al., eds.: Springer-Verlag, Berlin and Heiderberg. Plant Molecular Biology, 219-227 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Singh, U.S., Kohmoto, K.and Singh, R.P., eds.: Pergamon Press, Oxford. Pathogenesis and Host Specificity in Plant Diseases, Vol.II, 51-63 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Tusge, T.et al.: The Phytopathological Society of Japan. Molecular analysis of pathogenicity in Alternaria alternata pathogens. In : Molecular Basis for Gene-for-Gene Complementarity in Plant Diseases, 21-30 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Daniels, M.J.et al.: Kluwer academic Publ., London. Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions, Vol.3, 223-237 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kohmoto, K.and Yoder, O.C.: Tottori University, Tottori. Host-Specific Toxin : Biosynthesis, Receptor and Molecular Biology (Proceedings of the Second Tottori University International Symposium on Host-Specific Toxin, held at Tottori, 1993), 313 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] 甲元啓介: "植物病原糸状菌による宿主識別-宿主特異的毒素の介在とその分子機構-" 学術月報. 46. 1035-1042 (1993)
• [文献書誌] B.G.Turgeon et al.: "Cloning and analysis of the mating type genes from Cochliobolus heterostrophus" Molecular and General Genetics. 238. 270-284 (1993)
• [文献書誌] S.K.Nutsugah et al.: "Ultrastractural changes in pigeon pea cells caused by a host-specific toxin from Alternaria tenuissima" Ann.Phytopath.Soc.Japan. 59. 407-415 (1993)
• [文献書誌] H.Otani et al.: "Alternaria toxins and their effects on host plants" Canadian Journal of Botany. 72(in press). (1994)
• [文献書誌] K.Kohmoto & O.C.Yoder(eds.): "Host-Specific Toxin:Biosyntesis,Receptor and Molecular Biology(Proceedings of the Second Tottori University International Symposium on Host-Specific Toxin,1993)" Tottori University, 313 (1994)
• [文献書誌] O.C.Yoder et al.: "Genetics of polyketide toxin biosynthesis by plant patho-genic fungi,In:Industrial Microorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics,R.H.Baltz,G.D.et al.,eds." American Society for Microbiology,Washington DC, 217-225 (1993)
• [文献書誌] J.D.Walton et al.: "Cochliobolus,In:Pathogenesis and Host-Parasite Specificity in Plant Diseases,K.Kohmoto,R.P.Singh & U.S.Singh,eds." Pergamon Press,London(in press), (1994)
• [文献書誌] K.Kohmoto,H.Otani and T.Tsuge: "Alternaria alternata pathogens,In:Pathogenesis and Host-Parasite Specificity in Plant Diseases,K.Kohmoto,R.P.Singh & U.S.Singh,eds." Pergamon Press,London(in press), (1994)