| 研究概要 |
血管平滑筋からイノシトール1、4、5-三リン酸(IP_3)認識蛋白を精製するため,IP_3固定化レジンを作製した。はじめにIP_3認識蛋白が大量に存在するラット大脳可溶性分画をIP_3固定化カラムにかけた。IP_3結合活性を追跡しながら130kDと85kDの二種類の分子が新規のIP_3結合分子であることを発見した。決定した部分アミノ酸配列の相同性検索から85kD分子はホスホリパーゼCのdelta1型アイソザイム(PLCdelta1)であることが分かった。本研究では,自然発症高血圧ラット(SHR)の大動脈からPLCdelta1のcDNAをクローニングした姫路工大の八木澤仁助教授と共同で,次の目的で研究を推進した。(1)全遺伝子を発現させPLCdelta1が新規のIP_3結合蛋白であることを確認する。(2)部分欠失ミュータントの発現実験からPLCdelta1中のIP_3結合性ドメインを決定する。SHR-PLCdelta1遺伝子を発現ベクター(pGEX-2T)にサブクローニングしgluthatione-S-transferase(GST)との融合蛋白として大腸菌(菌株DH5a)に発現させた。ベクターをトランスフェクトした大腸菌の超音波破砕上清には,対照上清では認められなかった[^3H]IP_3結合活性が認められ,さらにgluthatione-Sepharoseカラムにかけると10mM-gluthationeで競合溶出した分画にのみ[^3H]IP_3結合活性が認められた。このように「PLCdelta1はIP_3結合分子であること」が証明された。またSHR-PLCdelta1遺伝子のいろいろな部位を欠失させたミュータントも発現ベクター(pGEX-2T)にサブクローニングし大腸菌に発現させた実験等によって結合部位はN末端から60番目までに存在することが分かった。
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