標的遺伝子組換えによるアミロイド前駆体たんぱく遺伝子の生体機能の研究

• 研究課題/領域番号: 05261210
• 研究種目: 重点領域研究
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 安波 道郎 熊本大学, 医学部, 助手 (80244127)
• 研究期間 (年度): 1993
• 研究課題ステータス: 完了 (1993年度)
• 配分額: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円); 1993年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
• キーワード: 標的遺伝子組換え / 未分化胚幹細胞 / アルツハイマー病 / アミロイド前駆体たんぱく

研究概要

アミロイド前駆体たんぱくの生体における役割を知るうえでアミロイド前駆体たんぱく(App)遺伝子変異マウスは有用と考えられるので、App変異マウス系統を樹立するためにマウス未分化胚幹細胞株を用いた標的遺伝子組換え実験を行なった。
APP695をコードするmRNAを構成する16のエキソンのうち第9エキソンをふくむ遺伝子クローンを単離し、これとネオマイシン耐性発現プラスミドpMC1neoを用い、第9エキソンに約1kbの外来DNAの挿入変異を惹起する標的用ベクターを作製して、マウス未分化胚幹細胞株CB1-4に電気穿孔法にて導入した。選択培地中でコロニーを形成する細胞を、(1)継代時の生着率を高く保つために約3コロニーずつプールして混合培養した群と、(2)培養期間を最小限にとどめるよう直ちに単コロニーからの培養をはじめた群につき、PCR法およびSouthern法によって挿入変異の有無を確認した。
(1)プールして混合培養した576プール(約1728コロニー)について、43プールに標的遺伝子組換えを検出した。標的組換えの相対頻度は、43/1728=1/40と算定された。6プールから限界希釈して得た胚幹細胞3クローンについて、挿入変異を確認した後CD-1マウスとのキメラ作製に用いたが、変異を子孫に伝えるような生殖系列キメラは得られなかった。(2)単コロニーからの培養群から203株を分離したが、このなかには標的組換えを検出できなかった。
以上、アミロイド前駆体たんぱく遺伝子第9エキソンにおいて、標的遺伝子組換えの相対頻度が1/40と比較的効率のよい標的用ベクターを作製することができた。これを用いて、現在さらに未分化胚幹細胞の変異細胞株からアミロイド前駆体たんぱく遺伝子の変異マウス系統の樹立を試みている。