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1.HDVリボザイム活性ドメインの設計
Beenらのプソイドノットモデルを参考にし、基質成分の13-mer、酵素部分の15-merおよび34-merの3本のRNAオリゴマー鎖からなる系を設計し、T7RNAポリメラーゼを用いた合成に必要なプロモーターおよびテンプレート部分の配列を含む2重鎖DNA(30、32、および51塩基対)を合成した。
2.T7RNAポリメラーゼの大量調製
T7RNAポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドを用い、大腸菌を利用してT7RNAポリメラーゼを大量に調製し、硫安沈澱および陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
3.T7ポリメラーゼ系を利用したRNAオリゴマー合成条件の検討
T7ポリメラーゼによるRNAオリゴマー合成の最適な反応条件を調べた。その結果、マグネシウムイオン濃度を、過剰に使用するヌクレオシド三リン酸の濃度とほぼ同じにすることが重要である事がわかった。
4.RNAオリゴマーの合成
上記の条件を用いて、RNAの合成を行い、ポリアクリルアミド電気泳動により分離精製し、3種類のRNAオリゴマーを得た。
4.^<15>N標識したRNAオリゴマー合成の予備実験
^<15>N標識したRNAの酵素的な加水分解とリン酸化により、標識したグアノシン三リン酸(GTP)を調製した。
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