| 研究課題/領域番号 |
05266201
|
|---|
| 研究種目 |
重点領域研究
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 研究機関 | 北海道大学 |
|---|
研究代表者 |
奥山 英登志 北海道大学, 大学院・地球環境科学研究科, 助教授 (90125295)
|
|---|
| 研究分担者 |
石川 鑛 北海道大学, 大学院・地球環境科学研究科, 教授 (80000834)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
1993
|
| 研究課題ステータス |
完了 (1993年度)
|
| 配分額 *注記 |
1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
1993年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
|
|---|
| キーワード | ハプト藻 / 脂肪酸不飽和化酵素 / 不飽和脂肪酸 |
|---|
| 研究概要 |
本研究ではハプト藻B株Δ3不飽和化酵素遺伝子のクローニングを中心課題として行った。
[方法](1)ゲノミックサザン法:ハプト藻B株の核DNAを各種制限酵素で消化し、シロイヌナズナのΔ15不飽和化酵素遺伝子に由来する、ECLによる蛍光ラベルをしたDNA断片(クローン296、302)をプローブとしてサザン法を行った。(2)ゲノムDNAを鋳型とするPCR法:B株の全DNAを鋳型とし、シロイヌナズナのΔ15不飽和化酵素遺伝子に由来する数種類のDNA断片を適宜組み合わせたものをプライマーとしてPCRを行った。PCR産物を電気泳動し、クローン296、302をプローブに用いてサザン法を行った。ポジティブクローンは大腸菌で増幅し、オートシケンサーを用いて塩基配列を決定した。(3)cDNAを鋳型とするPCR法:B株よりmRNAを調製した後、cDNAを合成した。cDNAを鋳型、(2)で用いたDNA断片をプライマーとしてPCRを行った。PCR産物に対しクローン296、302をプローブとしてサザン法を行った。
[結果](1)ゲノミックサザン法:各種制限酵素産物のいずれもがクローン296、302とも相補性を示さなかった。(2)ゲノムDNAを鋳型とするPCR法:PCR産物とクローン296、302とのサザン法により、2つのポジティブクローン(クローン26、27)を得た。これらをBluescriptを用いた系によりサブクローニングし、得られた6クローンをオートシーケンサーにかけた。最終的に既知の不飽和化酵素遺伝子群とのホモロジー検索に供することができたのは1クローン(クローン26C)であり、そのΔ15不飽和化酵素遺伝子とのホモロジーは30%以下であった。
(3)cDNAを鋳型とするPCR法:B株のライフサイクルを通じて18:5ω3のレベルの最も高い時期の細胞から調製したpoly(A)^+RNAからcDNAを合成した。このcDNAを鋳型としてPCRを行った。クローン296とクローン302をプローブとしてPCR産物のサザン法を行ったところ、9個のポジティブクローンが得られた。今これらのクローンのシーケンスを行っている。
|
