| 研究課題/領域番号 |
05454156
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
医化学一般
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
橘 正道 千葉大学, 医学部, 教授 (50009081)
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| 研究分担者 |
園田 智子 千葉大学, 医学部, 教務職員 (20143307)
石塚 俊治 千葉大学, 医学部, 助手 (50232294)
石嶌 純男 千葉大学, 医学部, 助手 (70184520)
鈴木 信夫 千葉大学, 医学部, 助教授 (90111426)
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| 研究期間 (年度) |
1993 – 1995
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| 研究課題ステータス |
完了 (1995年度)
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| 配分額 *注記 |
6,400千円 (直接経費: 6,400千円)
1995年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
1994年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
1993年度: 2,900千円 (直接経費: 2,900千円)
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| キーワード | ホスホリボシルピロリン酸合成酵素 / 核酸前駆体合成 / 結合タンパク質 / 活性制御タンパク質 / 分子接触 / 複合体 / ラット肝臓酵素 / 融合タンパク質 / 分子接触部位 |
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| 研究概要 |
核酸前駆体、ヌクレオチド合成の重要な調節因子の一つはホスホリボシルピロリン酸(PRPP)の細胞内濃度である。本研究ではPRPP合成酵素触媒サブユニットに結合し、活性を制御すると考えられるタンパク質(39kDa)の基本構造と性質を解析し、以下の成果を得た。1. 30kDaタンパク質のcDNAクローニングとその塩基配列の決定 39kDaタンパク質のプロテアーゼ分解ペプチドのアミノ酸配列を基に作製したプローブを用い、ラット肝cDNAライブラリーよりクローンを得た。塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、触媒サブユニットのそれと非常に高い相同性を示し、一部の領域を除き全領域で48%一致した。39kDaタンパク質をPAP39 (PRPP synthetase-associated protein)と命名した。2.特異抗体を用いた両タンパク質の分子接触の証明 PAP39に特異的なアミノ酸配列を選び、合成したペプチドに対する抗体をウサギより得た。触媒サブユニットに対してはモノクローナル抗体を作製した。ラット肝酵素のジメチルスベリミデ-トによる架橋産物をこの2種の特異抗体を用いて解析し、両タンパク質が直接結合していることを証明した。3.ラット肝PRPP合成酵素におれるPAP39の役割 肝酵素を隠やかな条件でトリプシン消化すると触媒サブユニットには変化なくPAP39が選択的に分解され、酵素活性が増加したことから、PAP39の活性抑制効果が示された。4. PAP39の遺伝子組換え法による作製 本タンパク質の過剰による細胞毒性を避けるため、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させ、グルタチオン-Sepharoseを用いて精製した。5. PAP39の触媒活性に対する効果の解析 触媒サブユニット(遺伝子組換え法で調製済)を1M MgCl_2処理により多量体を解離させ、上記4で得たPAP39-GST融合体を加えて再会合させると、触媒活性が抑制され、PAP39の抑制作用が明確となった。
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