| 研究課題/領域番号 |
05557042
|
|---|
| 研究種目 |
試験研究(B)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 研究分野 |
循環器内科学
|
|---|
| 研究機関 | 大阪大学 |
|---|
研究代表者 |
葛谷 恒彦 大阪大学, 医学部, 助教授 (80150340)
|
|---|
| 研究分担者 |
西田 昌司 大阪大学, 医学部・附属病院, 医員
星田 四朗 大阪大学, 医学部, 助手 (80238732)
堀 正二 大阪大学, 医学部, 講師 (20124779)
多田 道彦 大阪大学, 医学部, 教授 (90093434)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
1993 – 1994
|
| 研究課題ステータス |
完了 (1994年度)
|
| 配分額 *注記 |
18,000千円 (直接経費: 18,000千円)
1994年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
1993年度: 15,000千円 (直接経費: 15,000千円)
|
|---|
| キーワード | 心筋細胞 / 遺伝子発現 / 画像解析 / カルシウム / 内皮細胞 / 混合培養 / フォトン |
|---|
| 研究概要 |
本試験研究は、心臓における遺伝子・機能発現をより詳細に検討するため、in vivoの細胞間相互作用を保った混合培養系を作成し、光学顕微鏡下に細胞の遺伝子・機能発現を解析するシステムを作成することを目的とした。
1)培養系の確立
新生ラット、成熟ラットより心筋細胞、微小血管内皮細胞を単離培養し、種々の単培養、混合培養系を、顕微鏡系での観察可能なガラスチャンバー上に作成、その表現型を検討した。
2)遺伝子導入
従来のcell lineとは異なる、これら初代培養の心筋細胞への遺伝子導入を試みた。当初計画していたインジェクター購入が不可能であったため、リン酸カルシウム法、エレクトロフォレーションなどを検討し、リポフェクション法の改変により収率良く、遺伝子導入が可能となり、心筋特異的遺伝子発現調節領域の検討が可能となった。
3)顕微鏡系の作成
遺伝子発現の検出としてルシフェラーゼアッセイ、心筋細胞の機能発現の検出として細胞内カルシウム濃度をそれぞれ顕微鏡下で観測するため、微弱光検出装置、ならびに落射蛍光検出装置を付属させた倒立顕微鏡系を作成した。さらに、ステージ上での細胞機能の保持、インターベンションの負荷を可能とさせるため、微量高速潅流装置を付属させた。
4)機能発現
心筋細胞系での遺伝子、機能発現解析の端緒として、筋小胞体のカルシウム放出チャネルに着目し、in vitroでの遺伝子導入(2))に続いて、同細胞での細胞内カルシウム動態の画像解析を行った。時間経過を詳細に検討するため画像メモリーの増加が必要であったが、遺伝子導入細胞でのダイナミックな変化を記録することが可能であった。
光学的特性の差異により、微弱光測定と蛍光測定を同時に行うことが不可能なため、今後実験プロトコールの改良と、心筋細胞における他の遺伝子・機能発現系への応用を検討中である。
|
