| 研究課題/領域番号 |
05557057
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
外科学一般
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| 研究機関 | 大分医科大学 |
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研究代表者 |
樋口 安典 大分医科大学, 医学部, 助教授 (60040284)
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| 研究分担者 |
秋月 真一郎 大分医科大学, 医学部, 助手 (80159334)
瀬戸口 美保子 大分医科大学, 医学部, 助手 (20236110)
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| 研究期間 (年度) |
1993 – 1995
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| 研究課題ステータス |
完了 (1995年度)
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| 配分額 *注記 |
18,100千円 (直接経費: 18,100千円)
1995年度: 2,900千円 (直接経費: 2,900千円)
1994年度: 5,500千円 (直接経費: 5,500千円)
1993年度: 9,700千円 (直接経費: 9,700千円)
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| キーワード | CD14 / ショック / LPS / TNF-α / IL-1β / トランスジーン / クッパー細胞 / 単クローン抗体 / Kupffer / transgeve / recombinant / transgene / TNF / monoclonal antibody / metallotionein |
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| 研究概要 |
1.ウサギおよびラットCD14 cDNAの分離・ウサギおよびラットのCD14(rabCD14およびratCD14)cDNAを分離し、全塩基配列を決定した。2.リコンビナントCD14(rCD14)の作成:マウス、ウサギおよびラットのrCD14の全長およびLPS結合部であることが予測される部(アミノ酸番号57-64)を含むアミノ酸番号1-71の領域を発現させた(1-71蛋白)。2.抗CD14抗体の作成:マウスCD14に対するポリクロン抗体(pAb)および単クロン抗体(mAb)を作成した。エピトープを異にする数種類のmAbを得た。rmC5-3はCD14のC末端部を、rmA4-2,rmF4-3,rmA12-10はmCD14の中央部を認識することがmCD14の合成ペプチドを用いたELISA法で判明した。3.mAbの機能活性:in vitroにおけるLPSによるMφのTNF-α産生に及ぼすmAbの効果はrmC5-3はTNF-α産生を強く亢進した。他のmAbは軽度ながら抑制した。pAbは抑制した。この様になおLPSの作用を強く阻止するmAbはなお得られておらず、mCD14,rabCD14およびratCD14の1-71蛋白による抗体作成を行っている。4.抗体のTNF抑制効果の検討:これらのin vivoにおけるTNF遊離やショックにおよぼす効果を検討した。その結果、pAbのF(ab')2はin vivoでもTNF-αの血清濃度を低下させることを明かにした。mAbのin vivoにおけるTNF-α遊離抑制効果はなおを明らかでなく、functionalなmAbを得た段階でESに対する効果を含めて結論を出したい。5.マウス可溶性mCD14(smCD14)の検討:ELISA法により正常およびLPS刺激に伴うSmCD14およびTNF-αおよびIL-1βの推移を検討し、変化の意義を考察した。6.Kupffer細胞(KC)および腹腔MφにおけるmCD14、CD18、TNF-α、IL-1βおよびIL-6の発現形式から見たmCD14の意義:肝臓および腹腔MφのmCD14およびサイトカインの発現を検討した。これによりLPSによるサイトカイン遊離は少数のmCD14分子でトリガーが引かれることおよび余剰のmCD14の発現の意義を考察した。7.mCD14とFcγRII/IIIとの関係:FcγRII/IIIがmCD14近傍に存在すること、またmCDを介するLPSシグナル伝達にFcγRII/IIIが関与する可能性を明らかにした。8.膜結合型および非結合型rCD14遺伝子導入マウス(M14MおよびM14S)の作成と解析:メタロチオネイン遺伝子上流配列をプロモーターとし、nativeおよびC末端を欠如したsmCD14を産生し得るmCD14遺伝子を組み込んだトランスジーンを用いてM14MおよびM14Sを作成した。M14Sでは末梢血smCD14値が高いことをウエスタン法やELISA法で明らかにした。さらに、M14SではLPS投与後の末梢血TNF-αおよびIL-1βが低値であることを観察した。しかし、LPS大量投与によるESに対する有意の効果はなお得られていない。9.mCD14ノックアウト(KO)マウスの作成:現在KOマウスを作成中である。
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