| 研究課題/領域番号 |
05558090
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
分子生物学
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
関根 光雄 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (40111679)
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| 研究分担者 |
高橋 秀臣 日本ミリポア, R&D研, 主任研究員
西川 一八 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (60109262)
WADA Takeshi TOKYO INSTITUTE OF TECHNOLOGY,FACULTY OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY,RESEARCH A (90240548)
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| 研究期間 (年度) |
1993 – 1994
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| 研究課題ステータス |
完了 (1994年度)
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| 配分額 *注記 |
15,500千円 (直接経費: 15,500千円)
1994年度: 6,500千円 (直接経費: 6,500千円)
1993年度: 9,000千円 (直接経費: 9,000千円)
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| キーワード | 化学発光 / ビオチン / 標識 / RNA / 塩基配列決定法 / リン酸化 / ジホスフェート / リンカー |
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| 研究概要 |
初年度では3量体のレベルでRNAを3'末端ビオチン標識する新規ビオチン化法を開拓できた。そこで、本年度ではさらに3'末端ビオチン標識による化学発光法によるRNAの塩基配列の決定法への応用を3量体からオリゴマーレベルに研究を移行した。まず、ビオチンをシチジンの塩基のアミノ基に連結したシチジン3'、5'-ビスホスフェート誘導体を用いて、RNAリガーゼで酵母のフェニルアラニルtRNAを3'末端ラベルした。この標識体をビオチン-アビジンの抗原-抗体反応を原理とする化学発光法により、塩基配列を決定した。その結果、UVクロスリンク領域が3'末端付近ではあまりないことがわかり、3'末端から10塩基残基は解読できないことがわかった。そこで、ビオチンを3'末端のリン酸基に連結したデオキシシチジンを含むオリゴチミジレート(17量体)を合成した。これを用いて、RNAリガーゼで酵母のフェニルアラニルtRNAを3'末端ラベルしたところ、フェニルアラニルtRNAの3'末端まで明瞭に塩基配列を解読できることがわかった。
さらに、酵母のフェニルアラニルtRNAの5'末端標識法も開発することが出来た。5'末端にビオチンを導入したオリゴデオキシヌクレオチドを合成し、3'末端にはRNAリガーゼのよい基質になるプリン塩基をもつオリゴリボヌクレオチドを連結した。このキメラオリゴヌクレオチドと酵母のフェニルアラニルtRNAをRNAリガーゼで連結させたところ、ビオチン標識されたサンプルを得ることができた。これを用いて、化学発光法により塩基配列を決定した。その結果、フェニルアラニルtRNAの5'-末端付近も明瞭に塩基配列を読み取ることができた。
以上の検討で、当初の目標通りRNAの3'および5'末端標識法を確立することができた。
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