ボツリヌスC型毒素に対する受容体遺伝子のクローニング

• 研究課題/領域番号: 05670261
• 研究種目: 一般研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 細菌学(含真菌学)
• 研究機関: 札幌医科大学
• 研究代表者: 藤井 暢弘 札幌医科大学, 医学部, 教授 (90133719)
• 研究分担者: 木村 浩一 札幌医科大学, 医学部, 助手 (90177915) ; 横沢 紀子 札幌医科大学, 医学部, 講師 (50167722)
• 研究期間 (年度): 1993 – 1994
• 研究課題ステータス: 完了 (1994年度)
• 配分額: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円); 1994年度: 500千円 (直接経費: 500千円); 1993年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
• キーワード: ボツリヌスC型毒素 / 結合蛋白質 / 受容体蛋白質 / 遺伝子クローニング / ボツリヌス中毒 / 神経毒 / レセプター / 分子生物学 / C型毒素

研究概要

ボツリヌスC型神経毒素に対する受容体の遺伝子を明かにするために,NG108細胞からmRNAを抽出した後,cDNAの合成を行いZAP-XRベクターにクローニングし,得られたcDNAライブラリーからボツリヌスC1毒素に対する結合性蛋白質を産生しているクローンの選別を試みたが,バックグラウンドが高いために明かな陽性クローンの選別には成功しなかった。蛋白プローブとして神経毒素(分子量15万)全体を使用しているために擬陽性クローンが多くなる可能性が考えられたので,神経毒素の標的神経細胞への結合ドメインを含む領域を蛋白プローブとして用いることとした。このため,C1毒素遺伝子の結合ドメインを含む3′-末端側約650塩基(約200アミノ酸残基)に相当する領域をPCR法で増幅し,得られた増幅断片をpBluescript-IIにクローニングした後,pET発現ベクターに再クローニングした。pETベクターからの結合性蛋白質の発現は,C1毒素結合ドメインを認識している数種のモノクローナル抗体との反応性(ウエスタンブロット法)とNG108細胞へのC1毒素の結合を阻害することから確認した。
一方,NG108細胞膜上に存在すると考えられるC1毒素に対する蛋白質性の受溶体を単離して抗体を作成し,イムノスクリーニングによってcDNAライブラリーから陽性クローンを得るために,C1毒素あるいは結合ドメインを用いてNG108細胞膜蛋白質とのクロスリンク-免疫沈降法による検討を試みている。