| 研究概要 |
塩化アリル(AC)、アクリルアミド(AM)および2.5-ヘキサンジオン(HD)はいずれも神経毒性を有する産業化学物質であり、中毒の病理所見として、神経軸索内にニューロフィラメント(NF)が蓄積することが報告されている。今回は、このNFの蓄積の原因として考えられる、1)上記化学物質によるNF蛋白の修飾の結果としてのcalpainによる正常な分解の抑制、2)上記化学物質が直接calpainを阻害することによるNFの分解抑制の有無について検討した。
8週令のWistar系雄性ラット(各群6匹)に、AC(2.0mmol/kg)、AM(0.25mmol/kg)およびHD(2.5mmol/kg)を週5回、約3ヵ月投与し、後肢麻痺を示す神経中毒ラットを作成した。各動物の脊髄よりChiu&Nortonの方法でNF分画(P_2)、内因性のcalpainを含むTriton可溶性分画(S_1)を調製した。incubation mixture(1ml)の組成は0.2mlのP_2 sample(0.5mg proteinに相当)、0.7mlのbuffer(20mM Tris-HC1 〓7.4.5mM 2-ME)、0.1mlの50mM EGTAあるいは50mM Ca^<2+>で、これにcalpainとしては各動物から得られたS_1もしくは市販のcalpain(いずれも使用濃度はあらかじめ検討)を用いた。incubationは各動物につき【.encircled5.】mMEGTA+P_2.、【.encircled2.】5mM Ca^<2+>+P_2,【.encircled3.】5mM Ca^<2+>+P_2+S_1,【.encircled4.】5mM Ca^<2+>+P_2+市販calpainの4チューブを用い、反応開始後30分および60分後にサンプルを取りSDS-PAGEを行なった。また、【.encircled5.】5mM Ca_<2+>+control P2+(AC,AM or HD)S_1および【.encircled6.】5mM Ca^<2+>+(AC.AM or HD)P_2+control S_1の組み合わせを用いることにより、NF(P_2)の修飾の有無およびS1分画のcalpainの阻害の有無を検討した。
これまで得られた結果では、1)ACおよびAM中毒ラットにおける脊髄NFの分解のタイムコースには、対照群と比べて変化は観察されなかった。2)HD群では6例中4例でNFの分解が抑制されていた。しかし、今回のSDS-PAGEの結果からは、この所見がHDによるNF蛋白の修飾の結果かあるいはS1に含まれるcalpainの阻害によるものかは明らかではなかった、現在イムノブロット分析によりNFの分解産物の相違について検討中である。また、今後、同様の分析を坐骨神経を用いて検討予定である。
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