| 研究概要 |
ヒトLDLreceptor遺伝子(pLDLR-2)の真核細胞へのTransfection
1.Transfection
ヒトLDLreceptor geneのcDNAを持つPlasmid(pLDLR-2)を調整,選択用PlasmidとしてPVS2-neo,選択用ネオマイシンとしてG418を用い,Voltage 0.2kV,Time constant 18msecでElectronporationを施行した。
2.導入細胞のSelection
1)遺伝子導入CHO細胞のSelectionに関しては,常法に従いネオマイシン耐性Colony,すなわちStable colonyを単離培養した。
2)HepG2細胞に関してはStable colonyを得ることができなかったが,TransientのTransfectionには成功した。
3.pLDL-R2導入の確認
1)Binding assay
標識ヒトLDLを用いたBinding assayの結果,COH細胞,HepG2細胞共に野性型に比し親和性,結合能いずれも著明な増加を示した。
2)Western boltting
CHO-pLDL-R2及びHepG2-pLDL-R2の膜蛋白をSDS-PAGE(3-12%)を施行後,これをニトロセルロース膜に転写し,一次抗体として抗ヒトモノクロナールLDL抗体,二次抗体としてProtein Aを用いて130kDの位置に単一のバンドを認めた。
4.今後の検討
HepG2細胞へのStable colonyを得るため肝細胞に発現しやすいPromotorに組み込んだPlasmidを用いて検討を行なう予定である。
|
