| 研究課題/領域番号 |
05671888
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
人類遺伝学
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
平井 幸彦 日本医科大学, 医学部, 講師 (10089617)
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| 研究期間 (年度) |
1993 – 1995
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| 研究課題ステータス |
完了 (1995年度)
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| 配分額 *注記 |
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1995年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
1994年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
1993年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
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| キーワード | 遺伝子治療 / 組換えウイルス / アデノ随伴ウイルス / AAVベクター / パッケージング細胞 / パッケイジング細胞 / 抗ウイルス外殻タンパク抗体 / アデノ隨伴ウイルス / 抗ウイルス外殻タンパク抗血清 |
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| 研究概要 |
(1)試験管内構成法を開発するためには、AAVベクターのパッケイジング細胞の樹立し、その細胞内でのウイルス形成機構を解明する事が不可欠である。そこで、パッケイジング・プラスミドのみをHeLa細胞の染色体に組み込んだ細胞株(HA8)を樹立した。この細胞株に後にベクタープラスミドを組込み、アデノウイルス(Ad)を感染させると、ゲノムに組み込まれた組換えneoR-AAVが切り出され、パッケイジングされた。産生したAAVベクターの力価は、組み込まれた両者のプラスミドのコピー数に依存して上昇していた。この事より、この細胞株のライゼ-トはin vivoパッケイジング反応の際の反応液として使用可能であり、更にAAVベクターの大量産生系としても利用出来ると思われた。
(2)野生型AAVの外殻蛋白質の全遺伝子(1.8kb,87kDa)は大腸菌用融合蛋白質発現ベクター(pMAL-c)では発現されなかったので、C-末部の67kDaに対応する遺伝子を削除した発現ベクターを調製し、23kDaの外殻蛋白質をマルトース結合蛋白質との融合蛋白質として分離した。この23kDaの蛋白質は外殻を構成する3種の外殻蛋白質全てに含まれる為、これを抗原として、外殻蛋白質に対するウサギpolyclonalおよびmonoclonal抗体を作成した。
(3)試験管内構成系にてAAVベクターが作成された場合、反応系より選択的にAAVベクターを分離・濃縮する方法が必要である。そこで、硫酸セルロースを用い、ほぼ定量的にAAVベクターを生物学的力価を保持したまま100倍以上にに回収出来る事を確認した。この知見は力価の低いAAVベクターの分離・濃縮に重要である。今後、これらの成果を用いて、AAVベクターの試験管内構成系を確立したい。
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