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イネalpha-アミラーゼのアイソザイムの一つである。RAmy1Aは酵素活性部位近傍に1ケ所糖鎖結合部位を有している。本研究ではRAmy1Aの糖鎖結合部位を改変した変異体をgapped duplex法を用いて遺伝子工学的に作製した。野生型酵素及び変異体酵素を酵母を用いて分泌生産し、免疫アフィニティ吸着体を用いて精製した。精製した酵素を用いてその反応動力学的特性を検討した結果以下のような結論を得た。
1)糖鎖を除くことにより熱安定性が著しく低下した。たとえば80℃で処理した場合、野生型は20分後でも初期活性の50%近い活性を維持するのに対して、変異体では5分後に10%の活性しか示さなかった。この結果は糖鎖の存在が酵素の安定性に重要な働きを持っていることを示唆している。
2)可溶性デンプンに対するミハエリス定数(Km)の温度依存性を比較検討した結果、野性型の酵素は強い温度依存性を示すのに対して変異体酵素は一定値を示した。この結果は糖鎖が酵素の基質認識特性に強い影響を及ぼしていることを示唆している。また、最大反応速度(Vm)についても野生型の方が大きな値を示した。
アミノ酸配列の相同性の高いタカアミラーゼの3次元構造図をもとにすると、RAmy1Aの糖鎖結合部位は活性部位近傍のタンパク質表面に存在していると考えることができる。従って、上の2)で述べた結果は酵素の糖鎖と高分子の基質である可溶性デンプンの相互作用の有無によるものと考えることができる。この結果は遺伝子操作的に糖鎖結合部位の付与や削除によって、基質認識性などの酵素の反応特性を改変できることを示唆しており、工学的にも興味深い。
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