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リソゾームの代表的なシステインプロテアーゼとして知られるカテプシンB、H、Lの発現調節を検索する目的で、In situ hybridization法およびNorthern blotting法を用い、ラット肝組織中におけるこれら酵素mRNAの日周リズムの解析を試みた。
1.Northern blotting:プローブとして、ジゴキシゲニン標識したリボプローブ、および^<32>P標識したcDNAプローブを用い、まず予備実験として16時(明期の後期:タンパクレベルで最も発現が高い時間)のラット肝RNAについて解析した。その結果、各酵素に対応したRNAが検出されたが、ジゴキシゲニン標識を用いた方がバックグランドが高かったため、^<32>P標識したcDNAプローブを用いて日周リズムを解析した。24時間を6時点に分けて比較した結果、各酵素のmRNAは16時にピークとなるリズムを示したが、有意差は見られなかった。これはクッパー細胞におけるこれら酵素の発現が非常に高いためと思われる。そこでIn situ hybridization法にて肝細胞のみの発現を検索した。
2.In situ hybridization:プローブは実験の簡易性という点からジゴキシゲニン標識のリボプローブを使用した。その結果、主に肝細胞及びクッパー細胞に各酵素mRNAの陽性反応が見られ、それはクッパー細胞により強かった。しかし、肝細胞の反応を画像解析にて検索したところ、肝小葉内での分布に差は見られず、また日周リズムの解析でも、明瞭なリズムが見られなかった。現段階で、ジゴキシゲニン標識のリボプローブでは感度が低いことも考えられるため、現在^<35>Sで標識したプローブを用いて解析中である。
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