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1.簡便な活性測定法の開発
糖脂質シアル酸転移酵素は生体内の比活性がとても低いことから、活性測定は極めて繁雑でかつ習熟を要する。従って酵素を精製するにあたり、簡便な活性測定法の開発が必要であると考えられた。そこで申請者は近年普及しはじめたバイオイメージングアナライザーと逆相系薄層クラマトグラフィーを組み合わせた新しい活性測定法を開発した。本方法の利点は以下のとおりである。
(1)多数のサンプルを同時に測定できる
(2)操作が簡便である
(3)基質と酵素反応産物の分離を確認できる
(4)回収率が高い。本方法により、これまで1〜2日要していた活性測定が3〜4時間程度で行えるようになった。この成果はAnal.Biochem.に発表した(印刷中)。
2.糖脂質シアル酸転移酵素の精製の試み
上記の方法を用い豚各臓器のGM3合成酵素の比活性を測定したところ顎下腺に豊富に含まれていることが分かったので、顎下腺からの精製を以下に試みた。抽出に用いる界面活性剤を検討したところTritonX-100が効果的であることが分かった。不安定である抽出酵素はグリセロールにより安定化されることが分かった。またいくつかのクロマトグラフィーを検討したところ、P11陽イオン交換クロマトグラフィー、色素アフィニティークロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過が有効であることが分かった。
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