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1.PCR法によるヒトリンパ球アルカリホスファクターゼ(ALP)遺伝子の増幅と解析
(1).ヒト胎盤ALPおよびヒト肝ALP遺伝子の塩基配列を比較し、特にホモロジーの高い領域3カ所を選んでプライマーを作製した。
(2).ヒトリンパ球ALPを発現する悪性リンパ腫細胞株(Kobayashi cell line)からmRNAを抽出し、cDNAを合成した。
(3).(2)の合成cDNAをテンプレートとし、(1)で作製したプライマーを用いてPCR法を行ったところ、約400bpのPCR産物を得た。さらにこのDNA断片にシークエンスを行った結果、ヒト肝ALPcDNAにほぼ一致した塩基配列を示した。このことは、Kobayashi cell lineリンパ腫細胞からヒト肝ALP遺伝子を増幅した可能性も示唆される。現在、Kobayashi cell lineリンパ腫細胞、ヒト胎盤、肝、骨等のtotalRNAに(3)のPCR産物をDNAprobeとしてNorthern法を行い、(3)のPCR産物によって各組織由来のALPmRNAの発現が確認できるか否かを追試するとともに、そのサイズを比較検討中である。
2.cDNAライブラリーからのヒトリンパ球ALP遺伝子の単離
(1).上記1-(2)で合成したcDNAをlambdaファージベクター(lambda-ZAP)に組み込み、cDNAライブラリーを作製した。
(2).(1)のcDNAライブラリーに1-(3)のPCR産物をprobeとしてスクリーニングを行ったところ、3個の陽性プラークが得られた。今後、これらのプラークに組み込まれたDNA断片にシークエンスを行い、1-(3)のPCR産物および、ヒト肝等各種ALP遺伝子の塩基配列と比較検討する予定である。
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