| 研究概要 |
野性型 p53 cDNA をmetallothionein promoter(MT 11A)の下流に挿入した真核細胞発現ベクター(pMEP4 p53)を作成し、これをelectroporation法にてヒト肝がん細胞株(PH5T)に遺伝子導入して、その性状を解析した。ヒト肝がん細胞株PH5Tは、平成3、4年度奨励研究において樹立した細胞株で、17番染色体にLOHがあり、かつその短腕上にある p53遺伝子のコドン141に点突然変異があり p53産物の発現を欠いている。
野性型 p53 cDNAおよびコントロールとしてアンチセンス p53 cNDA を挿入したベクターを遺伝子移入すると、野性型では4コロニーのみ得られたのに対し、アンチセンス cDNAを挿入すると100以上のコロニーを形成した。それぞれ4コロニー、3コロニーをクローニングしてその性状を検索した。colony forming efficiencvy assay(5,000 cells/60 mm dish)を観察するとアンチセンス p53移入クローンは3/3でcolony formationを認めたが、野性型 p53移入クローンでは2/4しか認めなかった。次に100muMの塩化亜鉛でインダクションをかけるとアンチセンス p53移入クローンでは colony forming activityに変化を認めなかったが野性型 p53移入クローンはその cology forming activityが抑制された。またこれらの株をマトリジェルとともにヌードマウスに移植し、2日後に解剖・腫瘍病変をホルマリン固定してその形態を観察すると、野性型 p53移入クローンでは、核の濃縮、断片化等、アポトーシスを示唆する所見が認められた。
以上より、野性型 p53蛋白はPH5Tの増殖を明らかに抑制していることが証明され、PH5Tの腫瘍化の一段階として p53蛋白欠失による増殖亢進があることが示唆された。
|
