| 研究概要 |
ヒトパピローマウイルス(HPV)は、種特異性、組織特異性のきわめて高いウイルスであり、HPVを培養細胞内で増殖させる実用的な系は未だ完成しておらず、その生活環には不明な点が多い。そこで、自然宿主であるヒト表皮細胞中で、HPV DNAの複製が安定に維持される細胞株を樹立することを本研究の目的とした。まず、レトロウイルスベクターにHPV16型のE7遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子の両遺伝子を導入したものをヒト表皮細胞に感染させ、G-418存在下で選択して目的の遺伝子が導入された細胞株を得た。この細胞株は、半年以上に渡って培養が可能であり、しかもカルシウム存在下で正常ヒト表皮細胞と同様に分化することなどから不死化はしたものの正常ヒト表皮細胞に近い機能を保持しているものと思われた。次に、HPV47型のE2遺伝子の一部をブラストサイジンS(bsr)耐性遺伝子に入れ換えたものを大腸菌プラスミドDNAの一部として増殖させ、プラスミドベクターの部分を取り除いた後、HPV DNAを自己連結させ閉環状DNAを得た。HPV自身の複製にはE1およびE2蛋白が効率よく発現することが必要なので、HPV47型のE1やE2遺伝子を発現するプラスミドを作製し、これらと前記の自己連結させ閉環状HPV DNAをリポゾームを用いて上記の不死化したヒト表皮細胞株に同時に導入し、これらの細胞をbsr存在下で培養を続けた。上記の閉環状DNAが安定に数十個以上複製した細胞は、bsr遺伝子の発現が、bsr耐性を獲得するに十分となり、bsr耐性株として分離されることが期待される。しかし、目的の細胞株が得られなかったので、現在E1,E2遺伝子をより効率よく発現するプラスミドを作製しそれらの導入したヒト表皮細胞株を得つつある。今後、これらの細胞株にあらためて、前記の自己連結させ閉環状HPV DNAをリポゾームを用いて導入する予定である。
|
