| 研究概要 |
1) 本研究は、IL-1R/GSTの融合タンパク質を用い、IL-1Rの細胞内領域と特異的に結合するタンパク因子を同定、精製することを目的としている。ます、マウス、タイプI-IL-1RのcDNAをテンプレートとしてPCR法によりIL-1Rの細胞内領域部分のDNAフラグメントを増幅し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク発現ベクターpGENT2に組み込み、pCL1R/GSTプラスミドを得た。次にこのプラスミドを用い、大腸菌JM109株でIPTG刺激によりIL-1R/GST融合タンパク質の発現を行ったところ、期待された50kDaのIL-1R/GST融合タンパク質の大量発現がSDS-PAGE上で観察された。しかし発現されたIL-1R/GST融合タンパク質は、そのほとんどが不溶性分画に存在するため精製が難しく、現在のところSDS-PAGE上単一バンドになるまで精製されていない。現在、グアニジン法による可溶化とHPLC等によるIL-1R/GST融合タンパク質の精製を試みている。また、GST以外の他の融合タンパク発現系を現在検討中である。
2) 上記の実験と平行して、IL-1,TNFによるシグナル伝達経路,特にIL-8産生誘導に関与するプロテインキナーゼを検索する基礎的知見を得るため、各種プテインキナーゼ阻害剤の作用を調べた。その結果、胃癌細胞株MKN45細胞でのIL-1,TNFによるIL-8産生誘導および、IL-8遺伝子プロモーターの活性化は、プロテインキナーゼ阻害剤H7により濃度依存的に抑制されるが、HA1004やスタウロスポリンではIL-1,TNFの作用は抑制されないことがわかった。これらの結果から、IL-8遺伝子発現誘導におけるIL-1,TNFによるシグナル伝達にPKCとは異なるH7感受性キナーゼが関与することが示唆された。またIL-1,TNFによるIL-8産生はチロシンキナーゼ阻害剤であるハービマイシンAにより阻害されることから、IL-1,TNFによるIL-8産生誘導のいずれかのステップにチロシンキナーゼが関与していることが示唆された。
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