| 研究概要 |
我々は既に、Porphyromonas(以前はBacteroides)gingivalis株に特異的である40-kDa外膜タンパク質(40k-OMP)をコードする2.0kb EcoRI遺伝子断片(40k-OMP gene)のクローニングおよび全塩基配列の解読に成功している。この40k-OMP geneを、大腸菌とBacteroides種とのshuttle vectorであるpVAL-1のEcoRIサイトに挿入し、これをpMD170と命名した。pMD170を遺伝子導入装置SSH-10(島津)を使用し、エレクトロポレーション法により、大腸菌HB101内に導入し、Amp・Tcプレートにてコロニーを選択した。このコロニーが、リコンビナント40k-OMPを産生することは、抗40k-OMP抗体を使用し、Western-blotting法により確認した。次に、40k-OMP geneの欠損株を作成するために、pMD170に挿入されている40k-OMP gene中のopen reading frame(499-1540 bp)において、切断サイトを1カ所のみ持つ制限酵素の中からBalIを選択し、これによってpMD170を切断し、切断部位にクロラムフェニコール遺伝子を挿入することにより変異株の作成をこころみた。クロラムフェニコール遺伝子はpUC type vectorであるプラスミドpHSG396(宝酒造)をSau96Iで切断し、平滑末端化することにより得た。また、P.gingivalis381へのshuttle vector pMD170の移行は大腸菌との接合による方法は、Dyerらの方法(B.B.R.C.,182,1012,1992)に従い行い、またエレクトロポレーション法はYoshimotoらの方法(O.M.I.,8,208,1993)を参考にして、両方法により、pMD170の移行を試た。移行の効率はEmとKmを添加したBHI血液寒天培地上にて発育するP.gingivalisコロニーの数で確認した。現在のところ、エレクトロポレーション法において電界強度は12kV/cm、パルス幅1msec、パルス回数2回の条件でP.gingivalisコロニーの発現を確認したが、その効率は低く、改良を試みている。
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