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調書通り、筆者が開発したタンパク質合成法を用いて、RNAポリメラーゼ中に存在するバルナーゼ様のドメイン、RPSc(1-112)の合成を行った。まず、RPSc(1-112)のペプチド鎖を4つに分割し、それぞれのペプチドセグメントを固相法により合成した。システイン残基を含まないセグメントは、従来法通りBocアミノ酸を用いる固相法により調製した。システイン残基を含むものについては、チオール基の保護が必要となるため、新たな調製法の開発を行った。幾つかの方法を検討した結果、3-ニトロー2-ピリジンスルフェニル(Npys)アミノ酸を用いる固相法により、チオール基を2、4、6-トリメチルベンジル(Tmb)基で保護したセグメントを調製することができた。ついで、筆者の開発した縮合法を用いてセグメント同士を順次縮合した。得られた保護ペプチドをフッ化水素処理してTmb基を除去した後、HPLCにより精製し、目的物RPSc(1-112)を得た。目的物はアミノ酸分析、質量分析により確認することができた。
以上のように、システイン残基含有セグメントの調製法を確立できたことにより、筆者の開発した方法を用いて、システイン含有タンパク質の合成が可能となった。
続いて、第2の研究目的であるRPSc(1-112)のRNase活性の有無を検証した。バルナーゼの活性測定の手順に従い、RPSc(1-112)の酵素活性の測定を試みた。しかし、RPSc(1-112)は活性測定条件下で綬衝溶液にまったく溶解せず、現在の所、RNase活性を見いだすまでには至っていない。今後このドメインをRNAポリメラーゼ中の本来のコンフォメーションに再生する方法について検討し、その条件下で酵素活性を測定したいと考えている。
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