| 研究概要 |
1.ブタ及び牛肝臓から抽出精製されたプロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)の結晶化を目指した。
2.結晶化に必要な本酵素の高純度精製を行うにあたり、我々の実験設備ではいくつかの困難な点があったので、蛋白工学研究所の菊池正和博士に、精製標品の提供を受けた。
3.X線回折実験を行うための単結晶を得るために、結晶化条件の検索を行った。この第一段階として、タンパク質濃度を制御する沈殿剤の検索を行った。各種無機塩類、有機溶媒、有機高分子化合物について、タンパク質を沈殿させる有効性について検索を行ったところ、無機塩類では硫酸アンモニウムを用いた場合にのみタンパク質の沈殿が確認された。また有機溶媒では、2-メチル-2,4-ペンタンジオール及びエタノールを用いた場合に、有機高分子化合物ではポリエチレングリコール(平均分子量4000、6000、8000、20000)を用いた場合にタンパク質の沈殿が確認され、結晶化の沈殿剤として使用できる可能性を示した。
4.上記沈殿剤を用いて、様々の条件で結晶化を行った。検索した各パラメータは、タンパク質濃度、pH、沈殿剤濃度、温度である。また、結晶化の方法も蒸気拡散法だけではなく、バッチ法や微量透析法なども試みた。
5.その結果、ブタPDIを用いた場合には、いずれの方法及び条件からも結晶は得られなかった。
6.牛PDIを用いた場合には、これまでに、2-メチル-2,4-ペンタンジオール、ポリエチレングリコール(平均分子量4000、6000、8000)を用いた場合に50ミクロン程度の微結晶の生成が確認されていたが、今回新たに硫酸アンモニウムを用いた場合にも10ミクロン程度の微結晶の生成が確認された。しかし、X線回折実験を行うためには小さすぎる大きさであった。
7.本年度の研究から新たに牛PDIの結晶が得られたが、構造解析に結びつけられるものではない。PDIの機能については最近研究が進み、その立体構造に対する興味はますます大きくなっているが、未だに本酵素の構造解析に関する報告はなく、結晶化に成功したという報告すらない。今後より詳細な結晶化条件の検索が必要であるが、それに加えて本酵素の精製法の見直しも必要と思われる。
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