| 研究概要 |
1.ハブ毒PLA_2の大腸菌による発現型の改良
ハブ毒腺Asp-49-PLA_2の発現、リフォールディンブ、及び精製の改良を行い、大量かつ迅速に目的物を得た。即ち、Asp-49-PLA_2の8位MetをLeuへと置換し、融合タンパク質との切断を-1位Metを導入し、BrCNによる化学的切断で行った。リフォールディングは、低温で行うことにより収率が上昇した。さらに、リフォールディング後の精製は、ヘパリン-セファロースCL-6Bにより行った。PLA_2活性はKC1で溶出される単一ピーク中のみにあった。この純度を逆相HPLC及びSDS-PAGEにより確認した。ジスルフィド結合を含む構造の確認は、N端側アミノ酸配列分析及びペプチドマッピングにより確認した。200mL培地から最終標品2〜3mgが得られた。なお、(M8L)PLA_2は天然型とPLA_2活性は同等であった。
2.進化的変異に基づくPLA_2変異体デザイン
ハブ毒腺PLA_2アイソザイムは、加速的塩基置換により異なる機能を獲得したと考えられがCa^<2+>結合部位である49位AspをLysへ置換した(M8L,D49K)PLA_2及びリン脂質認識部位と考えられる58位AsnをAspへ置換した(M8L,N58D)PLA_2をデザイン、調製した。このデザインはアイソザイム間の進化的変異による。変異体cDNAの調製には、本研究費により設置したDNA増幅装置を用い、PCR法により行った。
3.進化的変異に基づくPLA_2変異体の機能解析
(M8L,D49K)PLA_2及び(M8L,N58D)PLA_2のリン脂質分解活性をみた。予備的測定であるがD49K体に活性はなく、N58D体では減少した。さらに詳細かつ種々の生理機能については検討中である。
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