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非筋細胞ミオシン重鎖のアイソフォームであるMHC-Bのアクチン結合部位に神経組織特異的に発現しているB1インサーションの機能及びその発現機構を明らかにすることを目的として今年度は以下の研究を行った。
(1)インサーション部分に相当する12merのペプチドを合成し、それに対するポリクローナル抗体を免疫ウサギから調製した。以下はこの抗体を用いた実験結果である。
(a)生後、日齢の異なるラットの脳から全タンパク質を抽出し、B1インサーションを含むミオシン重鎖アイソフォーム(MHC-B(B1))の発現量が変化するかどうかをイムノブロット法により調べた。その結果、B1の発現量が特に多い小脳において、B1は生まれた直後には発現しておらず生後2週目位から発現し始め、3週目でほぼAdultレベルに達することが判明した。
(b)小脳組織でのB1の発現部位を特定するために、小脳の凍結切片を用いてイムノヒストケミストリーを行った。MHC-Bアイソフォームのすべてのサブタイプを認識する抗体を用いて蛍光抗体染色をしたところ、プルキンエ細胞層と分子層が染色された。B1に対する抗体を用いた場合、プルキンエ細胞層が特に染色された。この結果は、MHC-B(B1)がプルキンエ細胞の細胞体に特に発現していることを示唆する。
(c)神経成長因子によって分化誘導されるPC12細胞において、B1インサーションの発現が神経繊維の伸長によって変化するかどうかを調べた。その結果PC12細胞ではB1の発現が全く見られなかった。
(2)B1インサーションの近傍をコードするゲノムDNAをPCR法により単離し遺伝子構造を解析したところ、エクソン-イントロンの接合部の配列を読み取ることがれきたので、B1は神経組織に特異的なAlternative splicingによって発現していることが判明した。
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