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1.枯草菌を大量培養して得られた未分画tRNAからドットブロットハイブリダイゼーション法を用いて目的のトリプトファンtRNAを精製した。
2.UGA、UGG、UAAコドンのそれぞれを翻訳領域の中央に含む人工mRNAの設計とその遺伝子の合成を行い、この遺伝子をpBluescriptに組み込んだ。さらにこのplasmidを用いて大腸菌の形質転換を行った。
3.得られた大腸菌をcloningしてplasmidを集め、これをT7 RNA polymeraseで転写を行い目的の3種のmRNAを合成した。
4.枯草菌のS30フラクションを用いて無細胞タンパク質合成系をつくり得られたmRNAを用いてペプチドの合成を行った。この結果、加えたmRNAの量に従って合成されるペプチド量の増加が見られ、人工mRNAがこの系で翻訳されていることがわかった。
5.さらに、トリプトファンtRNAをこの系に加えた場合、tRNAがアミノアシル化されている場合には、UGAでのreadthroughはtRNA量の増加とともに増加し、逆に、アミノアシル化されていない場合は減少の傾向がみられた。この結果から、トリプトファンtRNAはUGAのreadthroughの頻度と関連性があることがわかった。この現象がトリプトファンtRNA固有のものなのかをさらに確認したい。
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