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複合体形成時における蛋白性プロテアーゼインヒビターSSIの反応部位の構造研究--SSIのP1位カルボニル炭素の^<13>C-NMRシグナルのケミカルシフト変化の原因について

研究課題

研究課題/領域番号 05780481
研究種目

奨励研究(A)

配分区分補助金
研究分野 生物物理学
研究機関東京都立大学

研究代表者

矢田 洋子 (三宅 洋子)  東京都立大学, 理学部, 助手 (40244412)

研究期間 (年度) 1993
研究課題ステータス 完了 (1993年度)
配分額 *注記
800千円 (直接経費: 800千円)
1993年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
キーワードプロテアーゼインヒビター / ^<13>NMR / 安定同位体標識 / 切断結合
研究概要

本研究では、蛋白性プロテアーゼインヒビターの阻害機能の原因を明らかにするために、その切断結合(P1位残基)主鎖カルボニル炭素が複合体形成時にプロテアーゼの活性セリン残基からの影響受けているか、それが阻害機能の鍵であるか否かを明確にすることをめざした。プローブとしてP1位主鎖カルボニル炭素の^<13>C-NMR化学シフトを用い、インヒビターとしてSSI及びそのアミノ酸置換異体を用いた。SSIのP1位カルボニル炭素シグナルは、サブチリシンBPN'との複合体形成に伴って低磁場に3.7ppmシフトした。この大きな低磁場シフトが阻害機能の鍵であるかを検討するために、P1位をArg及びPheに変換した変異体SSIを用いて、複合体形成に伴うP1位カルボニル炭素の化学シフト変化を観測し、阻害定数(ki値)との関係を検討した。これらの変異体SSIは三浦らによって作成され、サブチリシンBPN'(SUB)に対する阻害活性は殆ど野生型と変わらず(Ki=10^<-11>-10^<-12>M^<-1>)、又M73Rはトリプシン(T)を強く阻害し(10^<-9>M^<-1>)M73Fはキモトリプシン(CHT)を阻害する(10^<-7>M^<-1>)ことが報告されている。結果は、次のようであった。M73F(P1;Phe)-SUB系では、野生型SSI(P1;Met)-SUB系とほぼ同じ3.7ppmの大きな低磁場シフトが観測された。また、Kiの10^4低いM73F-CHT系でも3.0ppmと大きな低磁場シフトが観測された。一方、M73R(P1;Arg)-SUB系及び、Kiが10^2低いM73R-T系ともほぼシフト変化はなかった。このことから、P1位主鎖カルボニル炭素の複合体形成に伴う化学シフトの大きな変化は、阻害活性の大きさよりも、P1位残基の種類(又はその疎水性の度合)に強く関係していることが明らかになった。このことは、P1位主鎖カルボニル炭素は活性セリン残基から大きな影響受けはおらず、そのシフトは遊離及び複合体におけるSSIのP1位側鎖の立体構造の違いを反映していることが示唆された。

報告書

(1件)
  • 1993 実績報告書

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公開日: 1993-04-01   更新日: 2018-06-07  

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