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私はグルタミン酸受容体遺伝子を改変したマウス個体をジーンターゲッティング法によって作成することを計画し、当該年度は相同組み換えをおこしたES細胞の単離までを行った。ジーンターゲッティング法は、ターゲッティングベクターとゲノムDNAとの相同組み換えを利用することによって、あらかじめ狙いをつけた遺伝子を改変させた胚幹細胞(ES細胞)を単離し、それをマウス胚腔ないにもどすことによって遺伝子改変マウスを作成する方法である。
私は、Gタンパク質共役型であるメタボトロピックグルタミン酸受容体のうちのサブタイプ1とサブタイプ5に関して研究を行ってきた。サブタイプ1に関しては、マウスゲノミックライブラリーより単離したクローン中より、アミノ酸をコードしているエクソンを固定し、このエクソン中にネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、さらにターゲッティングに用いる遺伝子断片の3'末端にジフテリア毒素Aフラグメント遺伝子を付加することによって、ターゲッティングベクターを構築した。線状化したターゲッティングベクターをES細胞へ電気穿孔法により導入し、このES細胞のうちで組み換えがおこっているものをG418耐性によって選別した。得られた細胞のゲノムDNAについてPCR法やサザンブロット法を行うことによって、相同組み換えが起こっていることを確かめた。サブタイプ5に関しては、マウスゲノミックライブラリーよりゲノミッククローンを単離し、ターゲッティングベクターの構築にとりかかった。また、サブタイプ5にオルターナティブスプライシングによると思われるバリアントが存在し、現在までに報告されている他のGタンパク質共役型受容体のバリアントとは構造的に異なる特徴を有していること、このバリアントの発現が脳において部位特異的に調節されている可能性があることを当該年度に明らかにした。
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