| 研究課題/領域番号 |
05807087
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
内分泌・代謝学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
塚田 俊彦 京都大学, 医学部, 助手 (10207334)
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| 研究期間 (年度) |
1993 – 1994
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| 研究課題ステータス |
完了 (1994年度)
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| 配分額 *注記 |
1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
1994年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
1993年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
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| キーワード | ベータガラクトシダーゼ / VIP / 遺伝子発現 / PC12 / cAMP / 膜受容体 / ACTH遺伝子 / AtT-20 / CAMP / POMC |
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| 研究概要 |
1.ベータガラクトシダーゼをレポーターとするキメラ遺伝子をACTH遺伝子の5'上流域とつないで作製し、これをACTH産生マウスAtT-20細胞に導入すると細胞特異的に発現した。これを利用して、ヒトACTH遺伝子上流域に存在する組織特異的エンハンサーを検出することに成功した。
2.ヒトvasoactive intestinal peptide(VIP)遺伝子の5'上流域を大腸菌のベータガラクトシダーゼ遺伝子につないだキメラ遺伝子をラット褐色細胞腫細胞PC12に導入した細胞(PCVG細胞)を用いて外来性受容体の検出が可能か否かを検討した。すでに単離されたヒト黄体形成ホルモン受容体(LHR)のcDNAを発現ベクターに組み込み、このプラスミド(pCDMV2AHLHR)をPC12-VG細胞にトランスフェクションした。この細胞をヒト絨毛性ゴナドトロピンで刺激すると、ベータガラクトシダーゼ活性の発現をX-gal染色により検出することができた。絨毛性ゴナドトロピン非刺激時にはベータガラクトシダーゼ陽性細胞は認められなかった。このように、PC12-VG細胞を用いた検出系で外来性のLHRcDNAを検出できることが明らかになった。その検出感度は100ng cDNA/10cm plateであった。
PC12細胞における内因性のVIP遺伝子発現を解析した。その結果、PC12細胞でforskolinおよびTRAの刺激によりVIPmRNAが出現することが明らかになった。さらに、forskolinとTRAで刺激すると培養液中に放出されることを明らかにした。またVIPでPC12細胞を刺激するとVIPmRNAが出現することを明らかにした。
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