出芽酵母のGO期の分子細胞生物学的解析

• 研究課題/領域番号: 05808065
• 研究種目: 一般研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 細胞生物学
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 三輪谷 博史 東京医科歯科大学, 医学部, 助手 (50222336)
• 研究期間 (年度): 1993 – 1994
• 研究課題ステータス: 完了 (1994年度)
• 配分額: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円); 1994年度: 600千円 (直接経費: 600千円); 1993年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
• キーワード: 出芽酵母 / 発現クローニング / GO期 / 発現ベクター / cDNAライブラリー / 細胞周期 / 出現クローニング / ベクター / cDNA / G0期

研究概要

得られている36個の酵母GO期突然変異体を野性株と掛け合わせを行なった結果8株は掛け合わせが起こらなかった。残りの28株について親株と掛け合わせて各々約20個の胞子を四分子解析したところ、約半数の17株が遺伝的に不安定であることがわかった。即ちメンデルの遺伝に乗っ取らない分離をした。このことは少なくとも2つ以上の変異に因ることを意味している。残りの11株について遺伝的なバックグラウンドによる影響を調べる意味で他の野性株と掛け合わせ各々約20個の胞子を四分子解析したところ、8株がメンデルの遺伝の法則に乗っ取らない分離をした。このことは遺伝的なバックグラウンドに影響される変異であることを強く示唆している。この時点で遺伝子解析に適した株は3つに絞られた。つぎに変異株どうしを掛け合わせてまた各々約20個の胞子を四分子解析したところ3種類の対立遺伝子に分類できることがわかった。出芽酵母のGO期に関係する遺伝子の単離を試みる目的で、はじめに突然変異体を得た条件で、発現クローニング法によりスクリーニングする条件の検討を行った。その結果、野生株でもこの方法でスクリーニングすると生存率が1/1000以下に低下することがわかった。これらのことより遺伝子の単離に至ることは、従来のスクリーニングの方法では単離が極めて困難であることがわかった。また私が発現法として用いたベクター系に、大きく分けて3つの重大な欠陥があることがわかった。1)導入したcDNAの発現プロモーターの方向に問題があって、選択マーカーのアンチセンスが転写され、選択マーカーの安定性が著しく低下する。2)導入したcDNAに含まれる転写終了シグナルとベクターの転写終了シグナルとのあいだに高頻度で欠損がおこる。3)出芽酵母での発現プロモーターが大腸菌でもはたらき、蛋白質まで翻訳されている可能性がある。以上の欠陥を修正した出芽酵母の発現系を作成しつつある。