| 研究概要 |
腐乱死体から採取したDNAは高度に分解しており、ポリメレース・チェイン・リアクション(PCR)法によるDNA増幅を阻害することが判明した。これは反応時のプライマーの結合や正確な複製を阻害するためであると考えられ、この損壊DNAを除去して残存している高分子量DNAのみから正確なPCR増幅を行う方法(精製法)を検討した。1つの方法としてアガロースゲル電気泳動やアガロースゲルビーズによるカラムクロマトグラフィについて検討したところ、高分子量DNAの残存している試料では増幅が可能となった。しかし損壊DNAの中には塩基部分が外れて1本鎖状となったものも含まれている可能性があり、それを除去してより確実なPCR増幅が可能となる、ハイドロキシルアパタイトを用いた精製法について検討した。
ハイドロキシルアパタイトは、含有するカルシウム・イオンとDNA鎖中のリン酸とが結合することによりDNAを吸着させるが、その結合の強さはDNAの立体構造に依存し、1本鎖DNAは2本鎖DNAよりも結合が弱く、両者の分離が可能となる。ただし蛋白質も結合してしまうため、蛋白分解酵素で処理した試料(蛋白未除去)から直接DNAを回収するのには問題ががあったので、フェノール/クロロフォルム処理等でDNAを精製した試料を対象とした。
一般に温度をあげると1本鎖DNAと2本鎖DNAの分離はより著明となると言われており、分子生物学実験法の教科書であるMolecular Cloning,A Laboratory Manualなどには加温する簡単な装置が紹介されているが、本研究ではより簡便な方法を考慮し、室温での分離の精度を検討した。しかし分離の程度は分別できるほど良くなく、加温法などに工夫する必要が認められた。今後さらに検討を重ねる予定である。
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