研究課題/領域番号 |
05J09329
|
研究種目 |
特別研究員奨励費
|
配分区分 | 補助金 |
応募区分 | 国内 |
研究分野 |
生理学一般
|
研究機関 | 筑波大学 (2006-2007) 大阪大学 (2005) |
研究代表者 |
青柳 靖之 筑波大学, 大学院・人間総合科学研究科, 特別研究員(PD)
|
研究期間 (年度) |
2005 – 2007
|
研究課題ステータス |
完了 (2007年度)
|
配分額 *注記 |
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2007年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2006年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2005年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
|
キーワード | NK4 / マイクロカプセル / 細胞封入 |
研究概要 |
これまでHepatocyte Growth Factor (HGF)とその受容体であるc-Metの関係をブロックする治療物質としてNK4を用いてきたがこれは癌細胞の増殖を抑制する静細胞的な効果物質である。更なる治療効果を上げるために積極的に細胞を殺す殺細胞効果のある物質の開発を考案した。c-Metとの結合部位であるNK4のN端配列の一部(NK1)と緑膿菌外毒素(PE)の一部を結合させた融合タンパク(NK1-PE)の作製を行った。 NK4プラスミドのNK1配列とIL13-PEプラスミドのIL13配列を組み替える事によりNK1-PEのコンストラクトを作製した。タンパク発現をlmM IPTG、37℃で3時間誘導を行い、不溶性に発現したタンパクを回収した後リフォールディング、FPLCによる精製を行ったが収量を増やす事は困難であった。次に収量を増やす為に上記で作製したコンストラクトのNK1-PE部分をpGEX-2Tベクターに組み込む事によりGSTタグを融合させたタンパクの作製を試みた。また宿主の菌はOrigami株を用いた。タンパク発現を0.lmM IPTG、24℃で一晩誘導する事により可溶性に発現する事ができた。このタンパクをグルタチオンセファロースに結合後、トロンビンによりGSTを切断して回収する事で問題を改善する事ができた。in vitroにて膵癌細胞にNK1-PEを添加し(0.1ng/ml〜100μg/ml)、72時間後に生死細胞の評価を行った。c-Metが高発現しているSUIT-2、 AsPc-1での殺細胞効果は決して高くなく、低発現のしているBxPc-3やMiaPaca-2である程度の殺細胞効果が認められた。 これは作製したNK1-PEがこれまで報告されているNK4が血管新生を抑制する経路上のc-Met以外の細胞表面上に発現している受容体に結合しPEの作用により死滅した可能性が示唆された。
|