DNA光回復酵素の結晶化とX線構造解析

• 研究課題/領域番号: 06263205
• 研究種目: 重点領域研究
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 三木 邦夫 京都大学, 理学部, 教授 (10116105)
• 研究分担者: 伊中 浩治 東京工業大学, 資源化学研究所, 助手 (30240758)
• 研究期間 (年度): 1994
• 研究課題ステータス: 完了 (1994年度)
• 配分額: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円); 1994年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
• キーワード: DNA修復 / 光回復酵素 / 結晶化 / X線結晶解析 / 立体構造

研究概要

X線結晶構造解析でタンパク質分子の立体構造を原子レベルで決定するためには、これに適する高分解能までの回折を与える良質の結晶が必要である。我々は、ラン色細菌Anacystis nidulansの光回復酵素の結晶化を硫酸アンモニウムを沈殿剤とする蒸気拡散法で行い、X線回折実験を行うに適当な結晶を得た。結晶は正方晶系、空間群P4_12_12(P4_32_12)に属し、格子定数はa=B=90.7 Å,c=135 Åであった。非対称単位中に1分子を含むと仮定すると、Vm値は2.6Å^3/daltonとなる。高エネルギー物理学研究所のシンクロトロン放射光でnative結晶の回折データを集積したところ、2.0Å分解能までの反射を得ることができた。さらに、位相問題を重原子多重同型置換法を適用して解決するために、これまでに数十種の重原子誘導体結晶を調節しそれらのx線回折実験を行った。そのうちC_9H_9HgO_2SNaにsoakngした結晶の2.0Å分解能の回折データを検討したところ、native結晶との差パタ-ソン図において、Hgの結合サイトを見いだすことができた。また。この結合サイトはanomalousの差パターン図上でも確認されたので、15-3Åの反対データを用いて重原子パラメータの精密化を行った。位相問題を解決するためには、さらにもう一つの重原子誘導体結晶が必要である。
また、光回復の際に用いる光の最適波長がラン色細菌のものとは異なるアカパンカビNeurospora crassaの光回復酵素の結晶化を、PEG4000を沈殿剤とする蒸気拡散法で行ったところ、3カ月後に角柱状の小さな結晶が得られた。さらに、結晶化条件を精密に検索し、X線解析が可能な大きさの結晶を得ることが必要である。