| 研究課題/領域番号 |
06274202
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| 研究種目 |
重点領域研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
友池 仁暢 山形大学, 医学部, 教授 (90112333)
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| 研究分担者 |
加藤 修一 山形大学, 医学部, 助手 (90260463)
熱海 裕之 山形大学, 医学部, 助手 (60151081)
山口 清司 山形大学, 医学部, 助手 (30239892)
中村 秀範 山形大学, 医学部, 講師 (30240675)
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| 研究期間 (年度) |
1994
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| 研究課題ステータス |
完了 (1994年度)
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| 配分額 *注記 |
2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
1994年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
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| キーワード | 遺伝子導入 / ヒトANP遺伝子 / 遺伝子発現 / 心筋肥大 |
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| 研究概要 |
家兎生体心へのヒトANP遺伝子の導入
(1)ヒト心臓cDNAライブラリーのANPマップに準拠してプライマーを決め、PCR法を用いてヒトANPcDNAを作成した。さらにcytomegalovirus(CMV)プロモーターを有する発現型ベクターpCR/CMVにANPcDNAを組み込み、宿主細胞(大腸菌)にトランスフォームして増殖させた。大腸菌を大量に培養した後、プラスミドを調整し、リン酸カルシウム法を用いてヒトpRc-hANPをトランスフェクションしG418でクローンを選択した。ANPmRNAの発現はNorthern blot analysisで、ANP蛋白の合成は免疫抗体法で確認することができた。
(2)家兎を清潔手術下に開胸し、心外膜を切開して心臓を露出せしめ、pRC-hANPを心室筋内に注入した。術後4日目に心臓を摘出し、グアテジン塩化セシウム法を用いてtotal RNAを抽出し1.2%アガロースゲルで電気泳動後,ナイロンメンブレンにブロッティングした。ANPcDNAをプローブにしてハイブリダイゼイションを行ったところ、明らかなANPmRNA遺伝子の発現を認めた。一部の心臓については4%パラフォルムアルデヒドで固定の後パラフィン包理を行ない薄切標本を作製した。anti ANPを一次抗体としてABC法を用いて組織染色を行ったところ、pRc-hANP注入部の心筋細胞にANPの局在を認めた。従って、ヒトANP遺伝子を家兎心臓に注入する事でANPmRNAの発現とANP蛋白合成が可能なことが明らかになった。
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