| 研究課題/領域番号 |
06282263
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| 研究種目 |
重点領域研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
山田 亮 久留米大学, 医学部, 助手 (50158177)
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| 研究分担者 |
七條 茂樹 久留米大学, 医学部, 講師 (30080592)
星野 友昭 久留米大学, 医学部, 助手 (00261066)
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| 研究期間 (年度) |
1994
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| 研究課題ステータス |
完了 (1994年度)
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| 配分額 *注記 |
1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
1994年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | 接着分子 / 癌 / 早期診断 / 遺伝子同定 |
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| 研究概要 |
1.タンパクレベルでの解析:抗LFA-1抗体(2F12)をもちいて胃癌細胞株MKN45.16より免疫沈降を行ない、SDS-PAGEによる解析を行なった。その結果、約200KDのブロードな分子量からなる単量体であり、N-結合型糖鎖を有する糖タンパクである事が明らかとなった。白血球LFA-1と異なり、インテグリンβ2鎖のassociationは認められず、2次元電気泳動では等電点6.0のシングルスポットとして検出された。
2.遺伝子解析:LFA-1特異的プライマーとRT-PCR法を用いたメッセージレベルの解析で、MKN45.16細胞ではLFA-1遺伝子が発現していない事が示され、ノーザンブロッティングでも確認された。また、low stringency下でハイブリダイゼーションを行なったところ、LFA-1メッセージよりも僅かに大きなサイズ(5.5-6Kb)のメッセージが確認された。これらのことより、LFA-1様抗原をコードする遺伝子はLFA-1遺伝子とは異なるが、ある程度ホモロジーがある事が示唆された。
3.LFA-1様抗原遺伝子のクローニング:MKN45.16細胞より真核細胞発現ベクターpME18Sを用いてcDNAライブラリーを作製しCOS-7細胞に発現させた。Seedらの方法の変法によりLFA-1様抗原遺伝子の濃縮・単離を行ない、最終的に2個のcDNAクローンが得られた。これらについて塩基配列の決定を行なったが、いずれのクローンも終始コドンにより分断されており、LFA-1様抗原をコードしえないことが示唆された。また、本法ではバックグランドが高いためクローンの濃縮効率が悪く、LFA-1様抗原遺伝子のクローニングには適さない事も判明した。そこで、LFA-1様抗原を精製し、部分ペプチドのアミノ酸配列の決定およびそれにもとずきクローニングを行なう事とし、現在、それらに着手しているところである。
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