| 研究課題/領域番号 |
06454076
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
大山 莞爾 京都大学, 農学部, 教授 (40135546)
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| 研究分担者 |
福澤 秀哉 京都大学, 農学部, 助教授 (30183924)
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| 研究期間 (年度) |
1994 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
7,200千円 (直接経費: 7,200千円)
1996年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
1995年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1994年度: 4,600千円 (直接経費: 4,600千円)
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| キーワード | ゼニゴケ / PACライブラリー / FISH / 性染色体 / CDPK / alternative splicing / サブトラクション / fingerprinting / カルシウム / 生殖器 / 性殖器官 / 分化 |
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| 研究概要 |
ゼニゴケの雌培養細胞のYACライブラリーを作製することを試み、50〜750kbのインサートを持つYACクローンを23個得た。約50kb約500kbの2種類のクローンをプローブに用いたFISHに成功した。しかし、YACのクローニングの効率が低いこと、そのままではシ-クエスができないことなどから、P1由来人工染色体(PAC)にベクターを変えてライブラリーを作製することにした。PACライブラリーの材料には雌雄の葉状体を用いた。現在までに50〜250kbのインサートを持つクローンを約5000個得ている。約50kbのインサートを持つPACクローンをプローブに用いたFISHでシグナルが得られ、残りのクローンの中から性染色体由来のクローンが存在する可能性が示唆された。
雌雄のゲノムの違いを検出するために、雌雄葉状体のゲノムDNAを鋳型にしてRAPD-PCRを行い得られたDNA断片の塩基配列を決定したところ、Ca^<2+>依存性タンパク質リン酸化酵素 (CDPK)と相同性のある遺伝子が見つかった。雌培養細胞のゲノムにおいてCDPKの全塩基配列を決定したところ、6番目のエキソン(6A、6B)が重複して存在しており、これらをalternative splicingによって使い分けていると予想された。そこで、雌雄培養細胞、葉状体、生殖器官より抽出したmRNAを用いて、エキソン5と7の間をRT-PCRにより増幅してその塩基配列を決定した。すると、いずれの器官においてもエキソン6Aのみを持つmRNAと、エキソン6Bのみを持つmRNAが作られていることが確認され、実際にalternative splicingがおこなわれていることが明らかになった。
雌性生殖器官と葉状体とのcDNAサブトラクションにより3種類の新規な遺伝子の断片が得られているほか、RNA fingerprintingによって多数の生殖器官特異的なcDNA断片を得た。
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