| 研究課題/領域番号 |
06506001
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究分野 |
生物生産化学・応用有機化学
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
磯部 稔 名古屋大学, 農学部, 教授 (00023466)
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| 研究分担者 |
日比 清勝 日本分光(株), 第2技術部・LC応用技術課, 主任研究員
市場 郁子 (大谷 郁子) 名古屋大学, 農学部, 助手 (40247680)
市川 善康 名古屋大学, 農学部, 助教授 (60193439)
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| 研究期間 (年度) |
1994 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
39,900千円 (直接経費: 39,900千円)
1996年度: 6,400千円 (直接経費: 6,400千円)
1995年度: 8,500千円 (直接経費: 8,500千円)
1994年度: 25,000千円 (直接経費: 25,000千円)
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| キーワード | 生物発光 / ジオキセタノン / タンパク質脱燐酸酵素阻害剤 / ホタル / 低温光酸素化 / 超高感度検出 / 固定化ルシフェラーゼ / トビイカ発光タンパク / ルシフェラーゼの固定化技術 / タンパク脱燐酸酵素阻害剤 / トートマイシン / 発光素子 / 発光タンパク / 蛋白脱燐酸酵素阻害剤 / 発光蛋白 |
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| 研究概要 |
生物発光系として発光物質・酵素・第3要素を必要とするホタルおよびトビイカの発光系を利用した。大腸菌にクローンし生産されているホタルルシフェラーゼを固定化する技術をすでに確立しているのでこの生物発光系を用いた。すなわち、ATPを含む緩衝溶液を定流量ポンプで送り、これに自動試料注入装置でルシフェリンを含む検体溶液を液送し、センサーとして透明チューブに充填した固定化ルシフェラーゼの上で発光させる。これをシングルフォトンカウンターを装備した検出器で検出し、コンピューターによりモニターする。これを数値計算し、データー処理系に移行して結果を報告するシステムを構築した。ATP濃度と、リアクター(固定化ルシフェラーゼ)の長さを最適化することにより、直線性は2x10^<-10>モル程度まで定量できるのみならず、同じ条件で検出限界は10^<-14>モルと超高感度化することに成功した。これを用いてタンパク質脱燐酸酵素(PP2 PP1 両タイプ)に対する阻害剤の阻害活性の実測にも成功した。さらに、沖縄のトビイカの発光タンパクの抽出・精製・部分構造決定にも本装置を活用することができた。熱帯地域の生物発光の新規材料の探索を行うこともできた。一方、発光の分子機構についても^<13>Cで100%標識したルシフェリン類似体を化学合成し、低温光酸素化法により発光中間体であるジオキセタノン構造の化合物のNMRスペクトル測定にも成功し、世界で初めてその存在を実証した。コンピューターではルシフェラーゼの分子形状を計算し、発光素子との分子間相互作用に関する計算機化学についても成果を得た。
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