| 研究課題/領域番号 |
06557013
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究分野 |
病態医化学
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
関 周司 岡山大学, 医学部, 教授 (50032884)
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| 研究分担者 |
サルカー A.H. 岡山大学, 医学部, 助手 (20284060)
秋山 公祐 岡山大学, 医学部, 助手 (30222540)
渡邉 晰子 (渡辺 晰子) 岡山大学, 医学部, 助手 (30093719)
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| 研究期間 (年度) |
1994 – 1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
4,700千円 (直接経費: 4,700千円)
1996年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
1995年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
1994年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
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| キーワード | 活性ブロッティング法 / Zymography / DNA修復酵素 / APEX nuclease / DNase I / アポトーシス / DNase Iアイソザイム / APEX AP endonuclease / 等電点電気泳動 / アイソザイム / 活性ブロッティング / ウエスタンブロッティング / ヒトグリオーマ細胞 / APEXヌクレアーゼ / DNA3′修復ジエステラーゼ / 活性ゲル / ゲル電気泳動 |
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| 研究概要 |
遺伝物質DNAの修復関連酵素の研究は、DNAの生理的代謝の研究の上で必要であるのみならず、アポトーシス、突然変異、がん、分子病、老化などの分子機構解明のために重要である。本研究では、このDNA修復関連酵素(特にDNA修復酵素、分解酵素、合成酵素など)のザイモグラフィカル(zymographical)な検出・定量法として、我々が考案した活性ブロッティング法の確立と応用について検討した。その結果、多機能DNA修復酵素であるAPEX nucleaseの5′AP endonuclease活性とDNA3′repair diesterase活性の検出・定量法として、きわめて有用であることが示された。すなわち、臓器や培養細胞からの粗抽出液をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分画したのち活性ブロッティング法で標的酵素を、容易に、zymographicalに検出、半定量をすることができた。また本法は、今日apoptosisとの関連において注目されているDNaseI様酵素(DNase I、CADあるいは3′OH端を生じるendonucleaseの全て)の組織中や体液中での検出・活性測定にきわめて有用であることが示唆された。すなわち、SDS-PAGE後活性ブロッティングすることにより,従来の活性ゲル法より2桁程高い感度で検出可能あった。さらに、等電点電気泳動後活性ブロッティングを施行することにより、DNase Iのアイソザイムパターンを容易に感度良く検出できた。
本研究確立したDNase I様酵素の活性ブロッティング法の応用的研究および本報告書で述べた以外のDNA修復関連酵素の中にも、本活性ブロッティング法の適用可能な酵素があるが、これらについての研究は今後の課題として残った。
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