| 研究課題/領域番号 |
06650928
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
生物・生体工学
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| 研究機関 | 熊本工業大学 |
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研究代表者 |
小川 隆平 熊本工業大学, 工学部, 教授 (40029244)
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| 研究分担者 |
長濱 一弘 熊本工業大学, 工学部, 助手 (50248605)
松岡 正佳 熊本工業大学, 工学部, 助教授 (10121667)
福田 秀雄 熊本工業大学, 工学部, 教授 (10150830)
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| 研究期間 (年度) |
1994 – 1995
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| 研究課題ステータス |
完了 (1995年度)
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| 配分額 *注記 |
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1995年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
1994年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
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| キーワード | エチレン / エチレン生成酵素 / Pseudomonas syringae / ヒスチジン / タンパク工学 / Pseudomonas syrimgal / PCR / シュードモナス / ジオキシゲナーゼ / 鉄結合部位 / 蛋白質工学 |
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| 研究概要 |
本研究はPseudomonas syringae pv. phascolicola PK2のエチレン生成酵素(EFE)遺伝子のタンパク工学的改変を行い、植物EFEの基質であるACCからエチレンを生成できるように変換することを最終目的とした。
1.EFE中にある10コのヒスチジン残基(His)を部位特異的突然変異手法を用いて、グルタミンに変化させた。その結果、H-189とH-233をグルタミンに変えることにより、EFE活性が完全に消失した。このことはH-189とH-233がFe(II)結合部位と考えられた。一方、H-268は1.3%のEFE活性が残存したが、基質である2-オキソグルタル酸の結合部位と推定した。
2.微生物と植物のEFEのハイドロパシープロットは、P.syringaeのEFE遺伝子から、疎水性アミノ酸領域(Pro93・Pro114)と親水性アミノ酸領域(Arg209-Ser226)を除くと植物由来のEFEのものとよく一致している。そこで、上記領域を欠失させたEFEを作成し、植物由来のEFE酵素へと構造変換できないか検討した。
(1)PCR法を用いて欠失EFE遺伝子断片を調整した。(2)得られた疎水部欠失部EFE遺伝子のものと、親水部欠失EFE遺伝子断片をそれぞれpUC18にライゲーションした。(3)欠失EFE遺伝子断片を含むプラスミドによる大腸菌の形質転換体を作成した。(4)2つの領域をそれぞれ除去したEFE遺伝子を含む大腸菌は、in vivo,in vitroで測定したところ、2-オキソグルタル酸、ACCからのエチレン生成酵素活性を消失していた。(5)形質転換体での欠失EFE遺伝子の発現の確認をウエスタンブロッティングで行ったが、現在のところ確認できていない。
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