| 研究課題/領域番号 |
06670771
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
小児科学
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
成高 信一 東京大学, 医学部・附属病院, 助手 (60179314)
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| 研究分担者 |
秦 堅佐工 (泰 堅佐工) 東京大学, 医学部・附属病院, 科長 (70189546)
林 泰秀 東京大学, 医学部, 講師 (30238133)
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| 研究期間 (年度) |
1994 – 1995
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| 研究課題ステータス |
完了 (1995年度)
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| 配分額 *注記 |
1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
1995年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
1994年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
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| キーワード | Gene targeting / ex vivo遺伝子治療 / in vivo遺伝子治療 / Wilson病 / LECラット / 初代培養肝細胞 / アデノウイルスベクター / 大腸菌LacZ遺伝子 / 遺伝子治療 |
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| 研究概要 |
銅代謝異常症の-つであるWilson病の遺伝子治療を想定し、以下のような実験を行った。Wilson病遺伝子および本疾患の動物モデルであるLEC(Long Evans Cinnamon)ラットの遺伝子はすでにクローニングされ、約70%のホモロジーが認められている。我々はこのLECラットのex vivo遺伝子治療を試みるために、肝細胞分離技術を確立した。特に初年度に確立された肝細胞分離技術の改善により細胞数生存率共に大きく向上した。枝術的に習熟したことはもとより、門脈カニュレーションの変更、脱血のタイミング、分離液に酸素投与を行ったことなどが寄与したものと考えられた。また肝部分切除術に関しても本実験に必要とされるレベルを確保できた。しかし肝細胞培養法に関しては依然として培養液をはじめ、いくつかの問題点を有するため、なお検討を必要とした。
遺伝子導入に関しては、基礎実験としてWister系ラット初代培養肝細胞を用い、アデノウイルスベクターによる大腸菌lacZ遺伝子の導入および発現を試みた。初代培養肝細胞を用いた実験においては蛋白レベルでその発現を確認することができた。第2段階は、本遺伝子を導入した培養肝細胞を門脈を介し、肝部分摘出ラットに注入し、その生着を確認することが、ex vivo治療の基礎的技術の最低限必要な条件となる。またその一方、アデノウイルスベクターを用いたin vivoでの遺伝子導入の有用性が明らかとなってきたため、ex vivo治療との比較という視点から当初の計画に加え、門脈、腹腔内、股静脈を用いてlacZ遺伝子導入を試みる実験を行った。経時的に摘出された各臓器について、免疫組織染色法により遺伝子発現の部位、時間的推移などについて検討した。しかしながら今回の実験では、両法ともに生体での蛋白発現を確認することができず、遺伝子導入上の問題、発現確認上の問題の双方から更なる検討が必要と考えられた。
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