| 研究課題/領域番号 |
06671683
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
産婦人科学
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| 研究機関 | 慶応義塾大学 |
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研究代表者 |
小林 俊文 慶應義塾大学, 医学部, 助教授 (30051460)
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| 研究分担者 |
橋場 剛士 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (60245553)
浅田 弘法 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (60231883)
久慈 直昭 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (80169987)
末岡 浩 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (90162833)
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| 研究期間 (年度) |
1994 – 1995
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| 研究課題ステータス |
完了 (1995年度)
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| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1995年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
1994年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | X・Y精子分離 / SRY遺伝子 / PCR / FISH / DXZ-1 / DYZ-1 / α-Satellite repeat sequence / Percoll遠心分離法 / α-satellite repeat sequence |
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| 研究概要 |
伴性劣性遺伝病患者の配偶子の性分離および初期胚を用いた着床前診断法の確立は、発生初期に保因者に対する疾患の発現阻止をする為に極めて重要な課題である。疾患遺伝子を用いた診断が切望されるが、単一細胞から正確に診断することが要求されるため、性診断には疾患発現の可能性を診断することは極めて実践的である。
第一に睾丸決定遺伝子(SRY)に対するプライマーを作製し、少量の細胞DNAより性の遺伝子診断法を検討した。羊水細胞、リンパ球、および精子を用いて、希釈法による細胞数に対する検出を検討した後に、マイクロマニピュレーターを用いて単一細胞を吸引サンプリングし、その検出について検討した。SRY遺伝子はsingle copyの遺伝子であるため、単一細胞での遺伝子増幅は安定性にはなお問題が残存した。
single copy遺伝子に対して、X、Y染色体は特異的なα-サテライトまどの数千コピーからなる繰り返し配列を有しており、この部分についての増幅を行なうことで、PCRでの増幅効率および精度は極めて良好となる。X染色体のDXZ-1、Y染色体のDYZ-1などがXおよびY染色体の繰り返し配列部分にあたる。また、PCRの検出に必要な遺伝子増幅サイクル数を減少させ、なるべくシンプルな操作で安定した検出結果を得るために、アニーリング温度などのPCRの至適条件を検討し、精度の高い検出条件を確定した。
さらに、多種のプライマーを用いて一度に複数の遺伝子増幅を行なうmultiplex PCR法を適用し、X、Yの診断精度を向上させることに成功した。単一プライマーによるPCRのバンド陰性例では、遺伝子の存在が否定的である場合の他に、amplification failure、sampling errorの可能性も否定できず、これに対しmultiplex PCRを開発したことにより、複数の遺伝子を同時に増幅し、1プライマーによるmisdiagnosisを回避することを可能とした。
これらの結果、本研究により性の遺伝子診断はより高感度で安定した方法への変遷として、SRYによるsingle coy遺伝子の性判定から、nested PCRの応用、繰り返し配列に対する増幅の効率上昇、single PCRへの単純化、そして最後にmultiplex PCRによる2DNAの同時増幅法を確立し、精度の高い診断法を可能とするに至った。
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